一种提取棉花线粒体及其蛋白质的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取棉花线粒体及其蛋白的方法。本发明专利技术的方法对线粒体机械损伤程度最小，可以有效的除去线粒体以外的核组分、质体组分，以及酚类、多糖类物质，降低污染率，提高线粒体蛋白质的纯度和质量。满足了棉花基因组研究、线粒体蛋白组及代谢调控网络等研究工作的实验技术需求，拓宽了相关研究工作的领域。

A method for extraction of cotton mitochondria and its proteins

The present invention discloses a method for extracting cotton mitochondria and its protein. The method of the invention to the degree of mechanical damage of mitochondria can remove the smallest nuclear mitochondrial group outside the effective and plastid fractions, and phenols, polysaccharides, reduce the contamination rate, improve the purity and quality of mitochondrial proteins. It meets the experimental technology requirements of cotton genome research, mitochondrial proteome and metabolic regulation network, and broadens the field of related research work.

【技术实现步骤摘要】
一种提取棉花线粒体及其蛋白质的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种提取棉花线粒体及其蛋白的方法。
技术介绍
线粒体蛋白质的提取主要分为线粒体分离和蛋白质提取两个环节。目前，用于高等植物线粒体分离提取的方法主要有差速离心法和密度梯度离心法等。差速离心法，虽然操作简单，是目前应用最广的方法，但所提取的线粒体纯度低、容易受核杂质污染，对后续的研究工作造成很大困难；密度梯度离心法，得到的线粒体纯度高，但操作复杂、耗时，长时间高速离心对离心机要求很高，对材料的需求量大，同时线粒体提取产量低。线粒体具有相对独立的遗传物质，植物细胞中，线粒体蛋白质仅占总蛋白质的约5％，因此，分离出高纯度的线粒体蛋白质，对于研究线粒体的蛋白组等都是必需的。和其他作物相比，棉花线粒体DNA，RNA和蛋白质的提取都较为困难，目前还没有关于棉花线粒体蛋白质提取方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种提取植物线粒体蛋白的方法。本专利技术提供的提取植物线粒体蛋白的方法包括如下步骤：(1)将植物样品进行匀浆，过滤，收集滤液；将所述滤液进行差速离心，收集沉淀；(2)洗涤步骤(1)获得的沉淀，得到体系A，将所述体系A进行差速离心，收集沉淀；(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入BufferB溶液，进行蔗糖密度梯度离心，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，即得到线粒体；所述蔗糖密度梯度离心的蔗糖密度梯度为将60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分层制备，得到蔗糖密度梯度；(4)从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白。上述方法中，所述从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白包括如下步骤：1)向步骤(3)获得的线粒体中加入裂解液，裂解反应，得到裂解反应产物；2)向所述裂解反应产物中加入苯酚抽提液，反应，离心，弃沉淀，收集上清液；3)将步骤2)获得的上清液与5倍体积的乙酸铵/甲醇溶液混匀，反应，离心，弃上清液，收集沉淀；4)用乙酸铵/甲醇溶液洗涤步骤3)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；5)用80％丙酮溶液洗涤步骤4)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；6)重复步骤5)；7)用体积分数为70％乙醇洗涤步骤6)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；并将所述沉淀悬浮于体积分数为80％的丙酮中，静置过夜；8)离心步骤7)获得的产物，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体蛋白。上述方法中，所述60％蔗糖溶液、所述52％蔗糖溶液、所述36％蔗糖溶液、所述20％蔗糖溶液的体积比为4:5:5:3；所述20％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述20％蔗糖溶液中的浓度为0.2g/ml；所述36％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述36％蔗糖溶液中的浓度为0.36g/ml；所述52％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述52％蔗糖溶液中的浓度为0.52g/ml；所述60％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述60％蔗糖溶液中的浓度为0.6g/ml。上述方法中，所述步骤(3)和步骤(4)间还包括如下纯化的步骤：用BufferB+溶液洗涤梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，离心，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体。上述方法中，所述洗涤的次数为4次。上述方法中，所述步骤(1)的匀浆过程中使用匀浆缓冲液，所述匀浆缓冲液的溶剂为水，溶质及其在匀浆缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mM、EDTA-Na25-10mM、KCl5-20mM、KH2PO410-20mM、BSA0.5-1g/L、二硫苏糖醇0.77-1.54g/L、β-巯基乙醇0.5-1ml/L；所述匀浆缓冲液的pH值为7.5-8.5；所述步骤(2)的洗涤过程中使用洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液的溶剂为水，溶质及其在洗涤缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mM、EDTA-Na25-10mM、KCl5-20mM、KH2PO410-20mM、Tris-HCl5-20mM；所述BufferB+溶液为在所述洗涤缓冲液中添加BSA得到的溶液；所述BSA在所述BufferB+溶液中的质量分数为0.05-0.1％；所述步骤(1)中，所述差速离心的步骤为：将滤液进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-2000×g离心5-15min；所述高速离心的条件为10000-15000×g离心30-60min；所述步骤(2)中，所述差速离心的步骤为：将体系A进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-1000×g离心10-20min，所述高速离心的条件为15000-18000×g离心30-60min；所述步骤(3)中，所述蔗糖密度梯度离心的条件为50000-100000×g，4℃离心60-120min；所述纯化步骤中，所述离心的条件为50000-100000×g离心25-30min。上述方法中，所述匀浆缓冲液的溶剂为水，溶质及其在匀浆缓冲液中的浓度为：蔗糖300mM、EDTA-Na27.5mM、KCl10mM、KH2PO420mM、BSA1g/L、二硫苏糖醇1.54g/L、β-巯基乙醇1ml/L；所述匀浆缓冲液的pH值为7.5；所述洗涤缓冲液的溶剂为水，溶质及其在洗涤缓冲液中的浓度为：蔗糖300mM、EDTA-Na25mM、KCl10mM、KH2PO420mM、Tris-HCl10mM；所述BufferB+溶液为在所述洗涤缓冲液中添加BSA得到的溶液；所述BSA在所述BufferB+溶液中的质量分数为0.1％；所述步骤(1)中，所述差速离心的步骤为：将滤液进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为1000×g离心10min；所述高速离心的条件为12000×g离心45min；所述步骤(2)中，所述差速离心的步骤为：将体系A进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为1000×g离心15min，所述高速离心的条件为18000×g离心30min；所述步骤(3)中，所述蔗糖密度梯度离心的条件为75600×g，4℃离心90min；所述纯化步骤中，所述离心的条件为75600×g离心25min或75600×g离心30min。上述方法中，所述裂解液的溶剂为水，溶质及其在所述裂解液中的浓度分别为Tris-HCl0.005-0.02mol/L、EDTA-Na20.01-0.05mol/L、CTAB1.0-3.0g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、NaCl1.0-1.8mol/L；所述苯酚抽提液是将pH8.0的Tris饱和酚与等体积提取缓冲液混匀得到的溶液；所述提取缓冲液的溶剂为水，溶质及其在所述提取缓冲液中的浓度分别为Tris-HCl0.05-0.1mol/L、SDS15-25g/L、蔗糖200-400g/L、β-巯基乙醇1-2ml/L；所述乙酸铵/甲醇溶液的溶剂为甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取植物线粒体蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将植物样品进行匀浆，过滤，收集滤液；将所述滤液进行差速离心，收集沉淀；(2)洗涤步骤(1)获得的沉淀，得到体系A，将所述体系A进行差速离心，收集沉淀；(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入Buffer B溶液，进行蔗糖密度梯度离心，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，即得到线粒体；所述蔗糖密度梯度离心的蔗糖密度梯度为将60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分层制备，得到蔗糖密度梯度；(4)从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种提取植物线粒体蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将植物样品进行匀浆，过滤，收集滤液；将所述滤液进行差速离心，收集沉淀；(2)洗涤步骤(1)获得的沉淀，得到体系A，将所述体系A进行差速离心，收集沉淀；(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入BufferB溶液，进行蔗糖密度梯度离心，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，即得到线粒体；所述蔗糖密度梯度离心的蔗糖密度梯度为将60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分层制备，得到蔗糖密度梯度；(4)从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白包括如下步骤：1)向步骤(3)获得的线粒体中加入裂解液，裂解反应，得到裂解反应产物；2)向所述裂解反应产物中加入苯酚抽提液，反应，离心，弃沉淀，收集上清液；3)将步骤2)获得的上清液与5倍体积的乙酸铵/甲醇溶液混匀，反应，离心，弃上清液，收集沉淀；4)用乙酸铵/甲醇溶液洗涤步骤3)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；5)用80％丙酮溶液洗涤步骤4)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；6)重复步骤5)；7)用体积分数为70％乙醇洗涤步骤6)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；并将所述沉淀悬浮于体积分数为80％的丙酮中，静置过夜；8)离心步骤7)获得的产物，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述60％蔗糖溶液、所述52％蔗糖溶液、所述36％蔗糖溶液、所述20％蔗糖溶液的体积比为4:5:5:3；所述20％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述20％蔗糖溶液中的浓度为0.2g/ml；所述36％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述36％蔗糖溶液中的浓度为0.36g/ml；所述52％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述52％蔗糖溶液中的浓度为0.52g/ml；所述60％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1MpH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述60％蔗糖溶液中的浓度为0.6g/ml。4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)间还包括如下纯化的步骤：用BufferB+溶液洗涤梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，离心，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述洗涤的次数为4次。6.根据权利要求1或3-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的匀浆过程中使用匀浆缓冲液，所述匀浆缓冲液的溶剂为水，溶质及其在匀浆缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mM、EDTA-Na25-10mM、KCl5-20mM、KH2PO410-20mM、BSA0.5-1g/L、二硫苏糖醇0.77-1.54g/L、β-巯基乙醇0.5-1ml/L；所述匀浆缓冲液的pH值为7.5-8.5；所述步骤(2)的洗涤过程中使用洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液的溶剂为水，溶质及其在洗涤缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mM、EDTA-Na25-10mM、KCl5-20mM、KH2PO410-20mM、Tris-HCl5-20mM；所述BufferB+溶液为在所述洗涤缓冲液中添加BSA得到的溶液；所述BSA在所述BufferB+溶液中的质量分数为0.05-0.1％；所述步骤(1)中，所述差速离心的步骤为：将滤液进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-2000×g离心5-15min；所述高速离心的条件为10000-15000×g离心30-60min；所述步骤(2)中，所述差速离心的步骤为：将体系A进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-1000×g离心10-20min，所述高速离心的条件为15000-18000×g离心30-60min；所述步骤(3)中，所述蔗糖密度梯度离心的条件为50000-100000×g，4℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：华金平，陈志文，聂虎帅，王梅燕，李双双，裴海丽，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11