牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法技术

本发明专利技术公开了牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于：该方法包括选牙、牙周膜剥离、牙周膜组织块离心、牙周膜干细胞分离，牙周膜干细胞培养、牙周膜干细胞纯化克隆、以及牙周膜干细胞增殖等步骤，本发明专利技术的有益效果是：通过对研究牙周膜干细胞的分离与体外增殖，为后期研究牙周组织工程的生物器官的构建和牙周膜再生治疗提供理论基础。分离纯化人牙周膜细胞，进一步认识其生物学特性，为后期研究牙周膜牙骨质复合体的人工生物器官的构建以及牙周膜再生治疗提供重要的理论依据。

Isolation and in vitro proliferation of periodontal ligament stem cells

The invention discloses a method for isolation and in vitro proliferation of periodontal ligament stem cells, which is characterized in that the method includes periodontal membrane peeling, periodontal tissue, centrifugal separation of periodontal ligament stem cells, cell culture, periodontal ligament stem of periodontal ligament stem cell purification and cloning, periodontal membrane the proliferation of stem cells and other steps, the beneficial effect of the invention is: through the study of periodontal ligament stem cells isolation and proliferation in vitro, for later study of periodontal tissue engineering organ construction and periodontal regeneration and provide a theoretical basis for treatment. Isolation and purification of human periodontal ligament cells and further understanding of their biological characteristics provide an important theoretical basis for the study of the construction of artificial organs of periodontal ligament complex and the treatment of periodontal ligament regeneration.

【技术实现步骤摘要】
牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法
本专利技术涉及干细胞
，尤其是涉及一种牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法。
技术介绍
牙周病是一类发生在牙周组织的慢性感染性疾病，其治疗以实现牙周组织的完全再生，恢复牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质的正常生理功能为最终目标，但是目前牙周组织缺损一直未能得到完全有效的再生。牙周膜干细胞属于成体干细胞，2004年由Byoung首次提出，并且证实了其在一定条件下能形成牙周膜牙骨质样复合体，这将为其组织工程化研究提供理论依据和可靠的细胞来源。近年来此项组织工程技术迅猛发展，为牙周病的治疗带来了新的希望。牙周组织工程包括生长因子、支架材料及种子细胞。因此，牙周膜干细胞作为一种新发现的干细胞，在牙周组织工程研究中有较大的应用前景。但是牙周膜组织量小、分离困难，一直成为制约牙周膜干细胞研究的重要原因。为了解决上述问题，本专利技术提出了一种牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，该方法通过对牙周膜干细胞进行分离，然后利用有限稀释法克隆纯化牙周膜干细胞，使牙周膜干细胞得到增殖。本专利技术的有益效果是：通过对研究牙周膜干细胞的分离与体外增殖，为后期研究牙周组织工程的生物器官的构建和牙周膜再生治疗提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法。为实现上述方法，本专利技术提供如下技术方案：牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤a，选择并收集12-18岁因正畸减数需拔牙患者而拔除的牙周健康的前磨牙，要求牙体无龋坏、无缺损，拔除后4h内送至实验室；步骤b，在超净工作台内，于无菌培养皿中用PBS液反复冲洗牙体3-4遍，然后使用无菌手术刀片，小心刮取根中1/3处的牙周膜，边刮取边用PBS液冲洗，使用眼科剪将刮取的组织块剪至最小；步骤c，将获取的牙周膜组织块离心，分离，培养；步骤d，采用有限稀释法克隆纯化牙周膜干细胞，使所述牙周膜干细胞增殖。所述步骤c中还包括以下分步骤：分步骤1，所述的牙周膜组织块转移至离心管中，在1000r/min条件下离心2分钟；分步骤2，弃掉所述离心管中的上清液，避光条件下分别加入1mLⅠ型胶原酶和1mLDispase酶，在37℃恒温水浴锅内消化40-50分钟；分步骤3，在所述消化过程中，每5分钟轻轻振荡所述离心管一次，至所述牙周膜组织消化为棉絮状；分步骤4，在1000r/min的条件下，经所述离心管离心5分钟，弃掉上清液，加入完全培养液2mL，重悬细胞；分步骤5，将所述重悬的细胞接种于六孔板中，在每孔中加入2mL的所述的完全培养液，置于5％的CO2孵箱中在37℃下培养；分步骤6，5天后初次更换培养液，以后每3天更换培养液一次，等待细胞在六孔板中长满80％。所述步骤d中还包括以下分步骤：分步骤01，取所述牙周膜干细胞培养的上清液，在1500r/min的条件下，在所述离心管中离心10分钟；分步骤02，取所述离心后的上清液，经0.22μm直径的小滤器过滤后，与培养基以体积比1∶1混合，作为适应性培养基。分步骤03，取所述牙周膜干细胞处于对数生长期的第一代细胞，用所述适应性培养基倍比稀释，调整细胞密度至每毫升10-15个，吹打混匀，接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养12小时后标记单个细胞孔，并补液至每孔200μL；分步骤04，所述96孔培养板中每5天换液，待所述牙周膜干细胞克隆长至孔底1/3-1/2后胰酶消化，扩大培养。本专利技术的有益效果是：通过对研究牙周膜干细胞的分离与体外增殖，为后期研究牙周组织工程的生物器官的构建和牙周膜再生治疗提供理论基础。分离纯化人牙周膜细胞，进一步认识其生物学特性，为后期研究牙周膜牙骨质复合体的人工生物器官的构建以及牙周膜再生治疗提供重要的理论依据。附图说明图1是本专利技术实施例1的整体流程示意图；图2是本专利技术实施例1的离心，分离，培养的过程示意图；图3是本专利技术实施例1中有限稀释法克隆牙周膜干细胞的过程示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。参照图1所示牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，该方法的实施步骤是：首先选择并收集12-18岁因正畸减数需拔牙患者拔除的牙周健康的前磨牙1，要求牙体无龋坏、无缺损，拔除后4h内送至实验室；之后在超净工作台2内，于无菌培养皿3中用PBS液反复冲洗牙体3-4遍，然后使用无菌手术刀片，小心刮取根中1/3处的牙周膜，边刮取边用PBS液冲洗，使用眼科剪4将刮取的组织块剪至最小；将获取的牙周膜组织块5离心，分离，培养；最终采用有限稀释法克隆纯化牙周膜干细胞6，使所述牙周膜干细胞6增殖。参照图2所示所述离心，分离，培养的过程中还包括以下步骤：将所述的牙周膜组织块5转移至离心管中，在1000r/min条件下离心2分钟；弃掉所述离心管7中的上清液，避光条件下分别加入1mLⅠ型胶原酶和1mLDispase酶，在37℃恒温水浴锅8内消化40-50分钟；在所述消化过程中，每5分钟轻轻振荡所述离心管7一次，至所述牙周膜组织块5消化为棉絮状；在1000r/min的条件下，经所述离心管7离心5分钟，弃掉上清液，加入完全培养液2mL，重悬细胞；将所述重悬的牙周膜细胞6接种于六孔板9中，在每孔中加入2mL的所述的完全培养液，置于5％的CO2孵箱10中在37℃下培养；5天后初次更换培养液，以后每3天更换培养液一次，等待细胞在所述六孔板9中长满80％。参照图3所示所述有限稀释法克隆牙周膜干细胞的过程包括以下步骤：取所述牙周膜干细胞6培养的上清液11，在1500r/min的条件下，在所述离心管7中离心10分钟；取所述离心后的上清液，经0.22μm直径的小滤器过滤后，与培养基12以体积比1∶1混合，作为适应性培养基13。取所述牙周膜干细胞6处于对数生长期的第一代细胞，用所述适应性培养基13倍比稀释，调整细胞密度至每毫升10-15个，吹打混匀，接种于96孔培养板14中，每孔100μL，培养12小时后标记单个细胞孔，并补液至每孔200μL；在所述96孔培养板14中每5天换液，待所述牙周膜干细胞6克隆长至孔底1/3-1/2后胰酶消化，扩大培养。对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本专利技术的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本专利技术。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本专利技术的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本专利技术内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。本文档来自技高网...

【技术保护点】
牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤a，选择并收集12‑18岁因正畸减数需拔牙患者而拔除的牙周健康的前磨牙，要求牙体无龋坏、无缺损，拔除后4h内送至实验室；步骤b，在超净工作台内，于无菌培养皿中用PBS液反复冲洗牙体3～4遍，然后使用无菌手术刀片，小心刮取根中1/3处的牙周膜，边刮取边用PBS液冲洗，使用眼科剪将刮取的组织块剪至最小；步骤c，将获取的牙周膜组织块离心，分离，培养；步骤d，采用有限稀释法克隆纯化牙周膜干细胞，使所述牙周膜干细胞增殖。

【技术特征摘要】
1.牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤a，选择并收集12-18岁因正畸减数需拔牙患者而拔除的牙周健康的前磨牙，要求牙体无龋坏、无缺损，拔除后4h内送至实验室；步骤b，在超净工作台内，于无菌培养皿中用PBS液反复冲洗牙体3～4遍，然后使用无菌手术刀片，小心刮取根中1/3处的牙周膜，边刮取边用PBS液冲洗，使用眼科剪将刮取的组织块剪至最小；步骤c，将获取的牙周膜组织块离心，分离，培养；步骤d，采用有限稀释法克隆纯化牙周膜干细胞，使所述牙周膜干细胞增殖。2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于：所述步骤c中还包括以下分步骤：分步骤1，所述的牙周膜组织块转移至离心管中，在1000r/min条件下离心2分钟；分步骤2，弃掉所述离心管中的上清液，避光条件下分别加入1mLⅠ型胶原酶和1mLDispase酶，在37℃恒温水浴锅内消化40-50分钟；分步骤3，在所述消化过程中，每5分钟轻轻振荡所述离心管一次，至所述牙周膜组织块消化为棉絮状；分步骤4，在1000r/min的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建国，周彦恒，施松涛，
申请(专利权)人：北京泰盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11