牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：通过一种新型的共载体系作为牙源性间充质干细胞介导软骨分化的载体，这种新型共载体系载有TFG‑β1、精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸(RGD)耦合的藻酸盐微球包裹着牙周膜干细胞或牙龈间充质干细胞。该共载体系是一个三维的可注射可生物降解的软骨组织工程细胞运载支架，通过体内体外试验验证了本材料是一种高质量软骨再生模型，并说明了微环境和诱导信号(TFG‑β1)对本材料中牙源性间充质干细胞存活和成软骨分化的重要作用，第一次介绍了PDLSCs和GMSCs两种有望运用于颞下颌关节修复的软骨再生种子细胞。

Method for carrying out cartilage regeneration by odontogenic mesenchymal stem cells

The invention discloses a method for odontogenic mesenchymal stem cells for cartilage regeneration, characterized by a new common carrier system as a carrier of odontogenic mesenchymal stem cells mediated by cartilage differentiation, the new total load system with TFG beta 1, arginine glycine aspartic acid amino acid (RGD) coupling the alginate beads wrapped in periodontal ligament stem cells or gingival mesenchymal stem cells. The total load system is a three-dimensional injectable biodegradable scaffold for cartilage tissue engineering carrier cells by in vitro and in vivo test shows that this material is a kind of high quality cartilage regeneration model, and explains the micro environment and inducing signal (TFG beta 1) plays an important role in cell survival and differentiation into chondrocytes of the charge the odontogenic mesenchymal stem material, first introduced PDLSCs and GMSCs two could be used in temporomandibular joint repair cartilage seed cells.

【技术实现步骤摘要】
牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法
本专利技术涉及干细胞
，尤其是涉及一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法。
技术介绍
间充质干细胞分化再生软骨是一种优良的组织工程方法，间充质干细胞是一种能接受天然微环境信号而多向分化的多能干细胞。当提供合适的生长因子，间充质干细胞在细胞球状培养和多种生物材料中能生成软骨和分泌软骨特有基质。在牙源性间充质干细胞中，牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞因其易从口腔和牙科操作废弃的生物组织中获取而拥有独特优势，且通过体内体外试验均验证了这些牙源性间充质干细胞的多向分化能力。间充质干细胞有效分化为软骨细胞需要核实的微环境和信号分子，如TFG-β1、BMP-4和FGF-2等生长因子。干细胞载体对于干细胞体内活动和再生过程也具有重要作用。因此，通过改造干细胞外基质的理化性质来设计一种合适的微环境，以创造合适的干细胞环境，而引导干细胞分化为特定表型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，为实现上述方法本专利技术提供如下技术方案：牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤a.祖细胞提取和培养选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史。为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*106个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组。步骤b.细胞流式分析选取数量约为5*105个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照。步骤c.生物材料的制备采用高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β1混合。步骤d.细胞的包被选取PDLSC和GMSC以及作为阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中以形成微球。所述步骤c中的生物材料的制备还包括以下分步骤：分步骤1：选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐；分步骤2：为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；分步骤3：将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。所述步骤d中的细胞包被还包括以下分步骤：分步骤1：将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；分步骤2：采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；分步骤3：将上述液滴逐滴滴入装有100mMCaCl2溶液的petri盘中进而形成微球；分步骤4：将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；分步骤5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。本专利技术所提供的方法有益效果是：利用RGD修饰的藻酸盐所具有的独特的三维支架结构，并添加有TFG-β1配体，包被着牙源性间充质干细胞，产生最佳的软骨再生效果，有望应用于颞下颌关节盘的重建和四肢骨骼修复。这种材料能够支持PDLSCs和GMSCs在体内和体外的存活、新陈代谢和成软骨分化，有望将其运用于颞下颌关节盘的软骨再生种子细胞。本系统包埋牙源性间充质干细胞容易操作，是一个三维可注射可生物降解的软骨组织工程细胞运载支架。附图说明图1是本专利技术的步骤流程示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例：参照图1所示，本专利技术所提供的一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法包括以下步骤：步骤1.祖细胞提取和培养选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史。为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*106个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组。步骤2.细胞流式分析选取数量约为5*105个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照。步骤3.生物材料的制备选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。步骤4.细胞的包被将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；将上述液滴逐滴滴入装有100mMCaCl2溶液的petri盘中进而形成微球；将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。步骤5.体外释放研究加载有TGF-β1(50ug/ml)的藻酸盐微球在含双抗(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)高糖DMEM培养基的中孵育1周(摇床，37℃，48孔板)。在选择的时间点，使用抗人重组TGF-β1免疫没脸检测盒来检测培养基中释放的TGF-β1。最后，通过使用10％柠檬酸钠溶解微球支架，释放微球中残留的TGF-β1，然后检测总的含量。步骤6.细胞存活率试验对包被的MSCs染色，钙黄绿素染活细胞，溴化乙锭染死细胞。活细胞百分比由ImageJ软件测量而得。此外，使用MTT试验检测MSCs的新陈代谢活性。步骤7.体外成软骨试验将包被的PDLSs、GMSCs和hBMMSCs(每ml藻酸盐中2*106个细胞)在含有15％FBS，2mML-谷氨酰胺，1％ITS，100NmDex，100uM维生素C，2mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM成软骨诱导培养基中培养。经过4周的诱导，4％多聚甲醛固定样本，制备石蜡切片。成软骨分化表现为软骨基质的形成，使用番红O和甲苯胺蓝可以使其阳性着色。因为藻酸盐的多聚离子会使背景着色增强，所以需先用不含Ca2+的PBS溶液洗片以在染色前去除交联的Ca2+而游离藻酸盐。然后使用Sox9和二型胶原的一抗免疫标记切片(4℃过夜)，然后用Alexa荧光标记的二抗检测(200倍稀释率)并用DAPI复染。每组包括三个独立样本，从每个样本中随机选出五个区域，然后用NIHImage-J软件计算这些区域中阳性着色的面积及其所占面积比例。步骤8.RNA提取、逆转录和扩增分别将上述含有TGF-β1和三种细胞的藻酸盐用人重组BMP-4(100ng/ml)或FGF2(50ug/ml)处理或者不处理。两周成软骨诱导后，提取10个藻酸盐凝胶中所有细胞的RNA，使用含50mM柠檬酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：步骤a.祖细胞提取和培养选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18‑25岁的健康男性成人，无牙周病史；为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*10

【技术特征摘要】
1.牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：步骤a.祖细胞提取和培养选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史；为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*106个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组；步骤b.细胞流式分析选取数量约为5*105个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照；步骤c.生物材料的制备采用高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β1混合；步骤d.细胞的包被选取PDLSC和GMSC以及作为阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中以形成微球。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建国，周彦恒，施松涛，
申请(专利权)人：北京泰盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11