牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法。其特征在于，利用海藻酸盐微球耦合RGD三肽装载TGF‑β3提供一个独特的肌腱组织工程3d细胞交架的方法来改善牙源性细胞分化成肌腱组织的微环境，同时评估了从牙周膜和牙龈中提取的干细胞与上述海藻酸盐微球复合参与肌腱再生的能力。通过体外及体内试验，证明了上述复合体系能够支持干细胞的活性和分化成肌腱样组织。建立牙源性MSC作为肌腱组织的再生的种子细胞，强调了微环境及感应信号(TGF‑β3)对于牙源性MSC的活性和向肌腱样组织分化起着重要的作用。该方法对优化肌腱再生及四肢骨骼的修复具有很好的应用前景。

Method for realizing regeneration of tendon tissue by periodontal ligament and gingival stem cell

The invention discloses a method for realizing the regeneration of tendon tissue by periodontal ligament and gingival stem cell. It is characterized in that the micro environment by using alginate microsphere coupled RGD three peptide loaded TGF beta 3 provides a unique framework for tendon tissue engineering 3D cell method to improve odontogenic cells to differentiate into tendon tissue, and evaluate the extraction from periodontal ligament and gums in stem cells and the alginate microspheres participate in tendon regeneration. The in vitro and in vivo experiments demonstrated that the composite system could support the activity of stem cells and differentiate into tendon like tissues. The establishment of odontogenic MSC as seed cells for tendon tissue regeneration, emphasizes the microenvironment and the induction signal (TGF beta 3) for odontogenic MSC activity and differentiation to tendon like tissue plays an important role. The method has a good application prospect for optimizing the tendon regeneration and the repair of limb bones.

【技术实现步骤摘要】
牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法
本专利技术涉及干细胞
，尤其是涉及一种装载TGF-β3、RGD修饰的并载入了牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞的海藻酸盐微球共载体系的牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法。
技术介绍
肌腱损伤可引起患者长期疼痛、不适和功能障碍。其有限的自我修复能力使得用再生治疗方法来功能性修复肌腱损伤显得尤为必要。间充质干细胞的应用可能为肌腱再生和修复提供新的治疗选择。因为取材方便，在牙源性间充质干细胞中的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞引来广泛关注，其可从口腔临床中废弃的生理组织中提取。该牙源性干细胞已经通过体内外的实验证明了其多向分化的能力。另外，因为牙周韧带含有肌腱样的胶原束，可以承受口腔咬合力，在肌腱再生治疗中，牙周膜干细胞表现出作为种子干细胞独特的潜力。研究表明TGF-β通路在肌腱再生中起着很重要的作用。TGF-β3由于它是一个与促进皮肤伤口和肌腱愈合无纤维疤痕形成有关的同种型。由TGF-β3引导的间充质干细胞分化，能促进肌腱组织形成。为了修饰微环境特性和引导细胞向特定表型分化，将海藻酸凝胶和RGD相结合。海藻酸盐能提供一种利于MSCs的空间分布的三维支架，从而能得到一种类似于体内微环境的结构组织。最近，本研究团队通过体内外实验发现，结合RGD的海藻酸凝胶可用于复合PDLSCs和GMSCs用作软骨再生，开发了一个能给牙源性MSCs(PDLSCs和GMSCs)的复合提供三维架构的共载体系。假设装有TGF-β3，复合PDLSCs和GMSCs的RGD修饰的海藻酸水凝胶微球具有肌腱再生能力，对肌腱组织工程是一项有前景的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤a.祖细胞分离和培养选择并收集18-25岁因需拔牙的健康患者第三周磨牙的牙龈组织和牙齿，要求无任何牙周病史，送至实验室；步骤b.生物材料制备选取RGD-coupled海藻酸盐作为支架材料，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β3混合。步骤c.细胞复合将上述混合有TGF-β3配体的海藻酸盐中复合牙源性干细胞，将其添加到CaCl2溶液中以形成微球。所述步骤b中还包括以下分步骤：分步骤1，选取RGD-coupled的海藻酸盐，对其进行纯化和部分氧化(2％)，以增加其降解性；分步骤2，收集该海藻酸盐、对其进行减压、冷冻及干燥处理；分步骤3，将上述经过处理后的海藻酸盐与TFG-β3进行混合。所述步骤c中还包括以下分步骤：分步骤1，将步骤b中所得到的含有TGF-β3的RGD-coupled海藻酸盐溶液分别与PDLSCs、GMSC两种细胞以2*106cells/mL的比例混合；分步骤2，逐滴将上述混合物(MSC-混合物)添加到100mMCaCl2的溶液中行成微球；分步骤3，将上述微球在37℃环境中孵育45分钟以完成交联；分步骤4，用不完全的DMEM清洗上述微球，清洗三遍。本专利技术所提供的方法有益效果是：通过含有TGF-β3配体的RGD三肽耦合海藻酸盐微球作为牙源性MSC的复合载体，改善了牙源性细胞分化成肌腱样组织的微环境，为肌腱组织工程提供了一个独特的3d细胞交架。GMSCs很容易从口腔中获取，或者从废弃组织中提取，这些MSC源可以被认为是理想的干细胞库来源，在基于MSC的组织再生中很有潜力，该方法对于优化肌腱再生以及四肢骨骼修复等方面都有潜在应用前景。附图说明图1是本专利技术的步骤流程示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例：参照图所示，本专利技术所提供的一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法包括以下步骤：步骤1.祖细胞分离和培养牙龈组织和牙齿是从二十岁左右的来自南加州大学的健康男性患者的第三磨牙中收集的(18-25岁)，无任何牙周病史的样本才能被纳入本研究。步骤2.生物材料制备和细胞复合使用RGD-coupled海藻酸盐(NovaMatrixFMCBiopolymer,Norway)作为支架材料。进行海藻酸的纯化和部分氧化(2％)来增加其降解性。随后，海藻酸盐被收集起来，在减压下冷冻干燥，和TGF-β3(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合。PDLSCs、GMSC和hBMMSCs(作为阳性对照)分别复合在含有TGF-β3配体的海藻酸盐中。细胞被复合在海藻酸盐的密度是2*106cells/mL。逐滴把MSC-海藻酸盐混合物添加到100mMCaCl2溶液中形成微球。形成的微球在37℃孵育45分钟来完成交联，然后用不完全DMEM洗三遍。没有细胞(也不带有TGF-β3)的RGD-coupled海藻酸盐水凝胶作为阴性对照。步骤3.活细胞/死细胞染色培养14天后，复合的MSC细胞的活性使用钙黄绿素染色活细胞和溴化乙锭二聚体染色死细胞(Invitrogen)。用NIHImageJ测量软件(NIH，Bethesda，MD)测量活细胞的百分比。通过没有RGD的复合牙源性MSC，hBMMSCs的藻酸盐微球培养14天后的活细胞/死细胞染色测定，来评估RGD三肽的存在对复合MSC的活性的影响。步骤4.扫描电镜(SEM)通过扫描电子显微镜(SEM)(JEOL5300,Peabody,MA)来观察微球的形态和结构特征。在常规培养基培养14天后，MSC藻酸盐微球用2毫升PBS洗一遍，用1％戊二醛固定过夜。样本使用酒精溶液分级脱水，溅射镀黄金，并用扫描电镜观察。步骤5.共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)使用CLSM(FluoviewFV10i,OlympusCorp,Tokyo,Japan)进一步来观察复合MSC的藻酸盐微球样品形貌。在培养的第14天，复合的细胞用多聚甲醛(4％)固定30分钟，用PBS(pH＝7.4)清洗，然后用0.1％Tritonx-100在室温下孵育5分钟。抗CD146-FITC和CD105-PE抗体(Abcam)作为MSC的阳性标记物。此外，抗CD34-PE抗体(SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz,CA)作为阴性标记物。所有的标本用DAPI进行细胞核染色复染。步骤6.体外释放曲线为了描述TGF-β3、RGD-coupled海藻酸微球的释放曲线，装载三个不同浓度(10、50、100毫克/毫升)TGF-β3，在500ulhigh-glucoseDMEM与100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素在48孔板中培养，37℃摇床一周。在每个选定的时间间隔(1、3、5、7、10、12、14天)收集其培养基，使用TGF-β3ELISA试剂盒(R&DSystemsInc.，Minneapolis，MN)来分析TGF-β3的释放。在释放曲线研究的最后，将余留的TGF-β3从微球中提取出来，通过50mM柠檬酸钠脱水溶液(SigmaAldrich，StLouis，MO)在蒸馏水本文档来自技高网...

【技术保护点】
牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤a.祖细胞分离和培养选择并收集18‑25岁因需拔牙的健康患者第三周磨牙的牙龈组织和牙齿，要求无任何牙周病史，送至实验室；步骤b.生物材料制备选取RGD‑coupled海藻酸盐作为支架材料，对其进行处理以提高降解性，并与TGF‑β3混合；步骤c.细胞复合将上述混合有TGF‑β3配体的海藻酸盐中复合牙源性干细胞，将其添加到CaCl2溶液中以形成微球。

【技术特征摘要】
1.牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤a.祖细胞分离和培养选择并收集18-25岁因需拔牙的健康患者第三周磨牙的牙龈组织和牙齿，要求无任何牙周病史，送至实验室；步骤b.生物材料制备选取RGD-coupled海藻酸盐作为支架材料，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β3混合；步骤c.细胞复合将上述混合有TGF-β3配体的海藻酸盐中复合牙源性干细胞，将其添加到CaCl2溶液中以形成微球。2.根据权利要求1所述的牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：所述步骤b中的生物材料制备还包括以下分步骤：分步骤1，选取RGD-coupled的海藻酸盐，对其进行纯化和部分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建国，周彦恒，施松涛，
申请(专利权)人：北京泰盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11