一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用，具体地本发明专利技术提供了一种子宫内膜干细胞增殖方法，所述方法包括步骤将子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的细胞浓度后，将细胞悬液在2‑10℃放置6‑8h；然后在‑20℃放置30‑40分钟，接着在‑70℃放置10‑18个小时，然后转入液氮中冻存；将液氮中冻存的子宫内膜干细胞取出，加入37℃预热的复苏液进行复苏。本发明专利技术提供的子宫内膜干细胞增殖方法，能够使得子宫内膜干细胞在液氮环境下，保持极高的存活，并且复苏后具有极高的复苏率，经传代培养仍然保持干细胞特性，适于大量扩增培养子宫内膜干细胞。

Endometrial stem cell proliferation method and application thereof

The present invention provides a method for endometrial stem cell proliferation and its application, specifically, the present invention provides a method for endometrial stem cells, the method comprising the steps of endometrial stem cells were mixed with liquid and frozen, adjust the cell concentration of the cell suspension, the cell suspension was placed 6 8h in the 2 10 DEG C; then in 20 C placed 30 in 40 minutes, then placed 10 70 DEG C for 18 hours, and then transferred to liquid nitrogen cryopreservation; liquid nitrogen frozen endometrial stem cells are removed, recovery liquid into 37 DEG C for preheating recovery. The present invention provides a method for cell proliferation of endometrial stem, can make the endometrial stem cells in liquid nitrogen environment, maintain high survival, and after resuscitation with high recovery rate, subculture still maintained the characteristics of stem cells, suitable for amplification of a large amount of endometrial stem cell culture.

【技术实现步骤摘要】
一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用。
技术介绍
干细胞(Stemcell，SC)是一种未分化细胞，这些细胞保持着高度增殖、自我更新和分化潜能的特性。干细胞可以定向分化为血液、骨骼、大脑及皮肤等其他组织。可能作为修复系统修复受损细胞。干细胞又可分为胚胎干细胞，脐血干细胞，成体干细胞及生殖干细胞等类型。干细胞在成体组织中调控成体细胞增殖、分化、凋亡及保持细胞数目的平衡中起到十分重要的作用。人的子宫内膜是一个高度再生组织，在育龄期妇女中要经历400多次的增殖、分化和脱落。人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，近年越来越多的研究表明，子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使子宫内膜始终保持自我更新和再生能力。现代妇产科学研究向细胞、亚细胞及分子水平发展，在体外成功的培养子宫内膜干细胞可为研究细胞的生长分化、代谢以及激素作用机制提供一个理想的实验模型。目前已经可以在体外培养扩增子宫内膜干细胞，用于科学研究、药物筛选测试、临床应用等。为了方便的取用体外培养扩增的子宫内膜干细胞，一般需要对培养出的子宫内膜干细胞进行冻存和复苏。目前，一般的干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，含血清冻存液成分复杂、价格昂贵且质量难以控制，因而无血清冻存的应用越来越多。用于干细胞无血清冻存的冻存液主要含有70％的无血清培养基、20％牛血清白蛋白(BSA)和10％二甲基亚砜(DMSO)。冻存程序一般采用梯度降温的方法，降温速度大约是1℃/分钟。对冻存的细胞进行复苏时，一般将冻存细胞直接置于37℃下解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心后搜集细胞继续培养。子宫内膜干细胞冻存后复苏率直接影响着后续的使用。为获得来源方便的子宫内膜干细胞，改进子宫内膜干细胞冻存复苏技术、建立一种子宫内膜干细胞增殖方法对开发子宫内膜干细胞的应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用。本专利技术提供了一种子宫内膜干细胞增殖方法，所述方法包括步骤：(1)细胞预处理将子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的细胞浓度后，将细胞悬液在2-10℃放置6-8h；(2)冻存将步骤(1)预处理过的子宫内膜干细胞细胞悬液在-20℃放置30-40分钟，接着在-70℃放置10-18个小时，然后转入液氮中冻存；(3)复苏将液氮中冻存的子宫内膜干细胞取出，加入37℃预热的复苏液进行复苏。优选地，所述步骤(1)中细胞浓度为3×106-7×106个/ml。优选地，所述步骤(1)中细胞浓度为5×106个/ml。优选地，所述步骤(1)中将细胞悬液在4℃放置7h。优选地，所述冻存液为：在DMEM培养液中含有：维生素C，15-20mg/ml；维生素E，0.1-0.3mg/ml；亚硫酸氢钠，2-6mg/ml；Nisin素，3-9mg/ml；BSA，0.05-0.08g/ml；DMSO，终浓度5-7％(v/v)。根更优选地，所述冻存液位在DMEM培养液中含有：维生素C，18mg/ml；维生素E，0.2mg/ml；亚硫酸氢钠，4mg/ml；Nisin素，6mg/ml；BSA，0.08g/ml；DMSO，终浓度6％(v/v)。优选地，所述复苏液为：在DMEM培养液中含亚硫酸氢钠2-6mg/ml。更优选地，所述复苏液为：在DMEM培养液中含亚硫酸氢钠4mg/ml。优选地，所述方法还包括步骤：(4)传代对步骤(3)复苏的子宫内膜干细胞进行传代扩增培养。优选地，步骤(3)中，将冻存的子宫内膜干细胞自液氮中取出后，在40℃水浴锅温育2-3分钟；加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬洗涤，离心去上清；重复洗涤步骤一次，即得复苏的子宫内膜干细胞。本专利技术提供的子宫内膜干细胞增殖方法，能够使得子宫内膜干细胞在液氮环境下，保持极高的存活，并且复苏后具有极高的复苏率，经传代培养仍然保持干细胞特性，适于大量扩增培养子宫内膜干细胞。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为P8子宫内膜干细胞的显微照片。图2显示了Nestin染色情况。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步陈述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例1子宫内膜干细胞的获得因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者(手术前3个月未服用激素类药物)，组织学诊断未发现子宫内膜有病理性改变。与患者签署知情同意书，并本着对患者尊重、保密及公正的原则进行取材，并保证患者的隐私不受伤害。在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，缓冲液(PBS)冲洗干净后，移入无菌的培养皿中，剪至lmm3大小放入冰浴DMEM/F12培养基(美国Hyclone)中。在培养皿中加入约2倍体积的的胶原酶I(150U/ml)，37℃消化50-60min，获得单细胞悬液。将消化好的单细胞悬液移入离心管，静置几分钟去除剩余的大块组织。1500rpm离心3min，基质细胞和上皮细胞存于上清液中。将分离的细胞悬液用台盼兰染色计数活细胞。按照2×105个/ml的细胞密度分别接种于75cm2的培养瓶中，DMEM/F12培养基中包含10％胎牛血清、青链霉素溶液，37℃、5％C02培养箱孵育，72h后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，以后每2-3天换液一次，并定时观察细胞生长情况，培养获得原代子宫内膜干细胞。原代细胞呈梭形，胞浆丰富透明，呈现中间稍宽两端尖的形态，细胞核呈卵圆形。实施例2子宫内膜干细胞的增殖经过大量的组分筛选和含量配比实验，本专利技术人最终确定的适用于子宫内膜干细胞冻存液和复苏液构成如下：冻存液：冻存液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen)中含有：维生素C，18mg/ml；维生素E，0.2mg/ml；亚硫酸氢钠，4mg/ml；Nisin素(Sigma)，6mg/ml；BSA(Sigma)，0.08g/ml；DMSO(Sigma)，终浓度6％(v/v)。复苏液：复苏液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen)中含亚硫酸氢钠4mg/ml。实验组1将实施例1中制备的子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的浓度为5.0×106个细胞/ml，将细胞悬液在4℃放置7h，然后在-20℃放置35分钟，接着在-70℃放置15个小时，然后转入液氮中冻存。经过4℃的预处理，子宫内膜干细胞复苏形态更为健康，而且在后续传代过程中，具有明显更强的增殖能力。15天后将冻存的子宫内膜干细胞自液氮中取出，在40℃水浴锅温育2-3分钟；加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬洗涤，离心去上清；重复洗涤步骤；然后加入1倍体积的复苏液重悬，进行自动细胞计数仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种子宫内膜干细胞增殖方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)细胞预处理将子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的细胞浓度后，将细胞悬液在2‑10℃放置6‑8h；(2)冻存将步骤(1)预处理过的子宫内膜干细胞细胞悬液在‑20℃放置30‑40分钟，接着在‑70℃放置10‑18个小时，然后转入液氮中冻存；(3)复苏将液氮中冻存的子宫内膜干细胞取出，加入37℃预热的复苏液进行复苏。

【技术特征摘要】
1.一种子宫内膜干细胞增殖方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)细胞预处理将子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的细胞浓度后，将细胞悬液在2-10℃放置6-8h；(2)冻存将步骤(1)预处理过的子宫内膜干细胞细胞悬液在-20℃放置30-40分钟，接着在-70℃放置10-18个小时，然后转入液氮中冻存；(3)复苏将液氮中冻存的子宫内膜干细胞取出，加入37℃预热的复苏液进行复苏。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞浓度为3×106-7×106个/ml；优选地，所述步骤(1)中细胞浓度为5×106个/ml。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将细胞悬液在4℃放置7h。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻存液为在DMEM培养液中含有：维生素C，15-20mg/ml；维生素E，0.1-0.3mg/ml；亚硫酸氢钠，2-6mg/ml；Nisin素，3-9mg/ml；BSA，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：汪娟，
申请(专利权)人：兰赫上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31