将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合、重编程试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种可将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合和重编程试剂盒。以人胃上皮细胞为起始细胞，以人胃肌成纤维细胞作为滋养层，用选自FBP、Bay K 8644、Bix01294、SB431542或A83‑01、VPA、RG108、PD0325901和PS48中的全部或多个包括SB431542或A83‑01在内的化合物组合可将人胃上皮细胞谱系重编程为内胚层干/祖细胞。

【技术实现步骤摘要】
将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合、重编程试剂盒
本专利技术属于细胞工程
，特别是涉及一种可将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合、重编程试剂盒及应用。
技术介绍
干细胞技术多次被《自然》、《科学》等杂志评为二十一世纪生命科学领域最具发展前景的技术，是攻克各种传统医学治疗手段力所不及的重大疾病的一种全新的医疗技术。干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在器官组织再生、疾病模型建立、发育生物学及药物研发等领域具有广阔的应用前景。近10年来，干细胞理论与技术研究取得了飞速的发展，有望成为全新的疾病治疗方式，推动医学治疗的范式转换，引领新的医学革命。干细胞有多种不同的分类方法，从发育的角度来看，干细胞大致分为胚胎干细胞(Embryonicstemcells)(ESCs)和成体干细胞(Adultstemcells)两大类。ESCs来源于囊胚期的内细胞团(Innercellmass)(ICM)，是一类具有无限自我更新和向人体所有细胞类型进行分化的多能性干细胞。1998年，Thomson在世界上首次建立了人胚胎干细胞系(hESCs)[ThomsonJA,Itskovitz-EldorJ,ShapiroSS,WaknitzMA,SwiergielJJ,MarshallVS,etal.EmbryonicStemCellLinesDerivedfromHumanBlastocysts.Science.1998；282:1145-7.]，由于其能够产生成体所有细胞类型，理论上能为基础研究、疾病治疗和药物研发提供理想的细胞来源。多年来利用ESCs已经产生了多种功能性细胞，包括心肌细胞、神经细胞、血细胞和肝脏细胞等[MurryCE,KellerG.DifferentiationofEmbryonicStemCellsto&#xa0；ClinicallyRelevantPopulations:LessonsfromEmbryonicDevelopment.Cell.132:661-80.]。然而，ESCs的使用在国际上面临着伦理学的争议，而且ESCs来源的细胞移植后会产生免疫排斥反应，未分化的ESCs会形成畸胎瘤等诸多问题，因此大大限制了其走向临床的应用。而成体干细胞存在于出生后各个阶段的多种组织中，具有一定的自我更新能力并且能够向其来源组织中的成熟细胞进行分化，如造血干细胞、间充质干细胞、肝脏干细胞和神经干细胞等。由于其来源于成体组织且只能向固定的方向分化，因此不具有成畸胎瘤的风险，也没有伦理学的问题，所以是临床疾病治疗的良好种子细胞。但其来源毕竟有限，只能从人体组织中分离获得，而且分化潜能也很局限只能生成其所在谱系内的一种或几种成熟细胞类型，体外也很难大规模的扩增，所以其临床应用也有很大的局限性。多年来，众多的研究都在致力于寻求更为理想的细胞类型来进行疾病的治疗、药物研发和机制研究。传统的表观遗传学观点认为谱系的特化、细胞的分化是单向的、不可逆的过程，多能的细胞状态只能向终末成熟的细胞状态进行命运特化(Waddington’epigeneticlandscape)。而诱导多能性干细胞(inducedPluripotentStemCells)简称iPSCs的出现深刻的改变了这一观念。2006年日本科学家Yamanaka利用ESCs特异性的4个多能性相关的转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC(OSKM)成功的将成纤维细胞转换为类似ESCs的多能性干细胞iPSCs，首次证实了终末分化的细胞在多能性相关转录因子的作用下可以重新获得分化多能性，这就是经典的重编程技术[TakahashiK,YamanakaS.InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdultFibroblastCulturesbyDefinedFactors.Cell.126:663-76.TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,NaritaM,IchisakaT,TomodaK,etal.InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactors.Cell.131:861-72.]。iPSCs的出现具有里程碑式的意义：首先，它突破了经典的表观遗传全景模式，极大的丰富了细胞命运转换的理论，引领了细胞命运研究和干细胞研究的范式转换，给再生医学的基础研究和临床应用开辟了广阔前景。其次，iPSCs具有ESCs的无限自我更新和向体内所有细胞类型进行分化的潜能，同时避免了ESCs研究和应用的伦理学争议。再次，由于成纤维细胞可取自病人自体因此也避免了ESCs分化产生的终末细胞移植入体内带来的免疫排斥问题。最后，病人自体来源的iPSCs可以建立个体特异性的疾病细胞模型和个体化的药物筛选平台。iPSCs的出现不仅给疾病的基础研究，药物筛选带来新的研究模式，而且使多能性干细胞(PSCs)走向临床应用跨进一大步。利用iPSCs已经成功的产生了多种功能性细胞类型，而且iPSCs来源的视网膜色素上皮治疗致盲性眼病的临床试验正在开展。Yamanaka也因此项技术而获得2012年的诺贝尔生理学或医学奖。尽管iPSCs具备多方面的优势，是一种非常具有治疗前景的细胞类型，然而由于同样具有ESCs类似的多能性依然难以避免致畸胎瘤的风险，此外iPSCs向功能性细胞进行分化的过程中存在随机性分化的问题，会产生多种非预期细胞类型，这些问题都会对大规模的临床应用带来安全性的风险。为了弥补这一缺陷，近年来基于iPSCs技术和原理发展而来的谱系重编程(lineagereprogramming)技术日益受到广泛的重视。谱系重编程主要使用目的细胞谱系特异性的转录因子(lineagespecifictranscriptionalfactors)而非多能性的转录因子(OSKM)在起始细胞主要是皮肤成纤维细胞或血细胞中进行过表达，进而将起始细胞直接转换为目的细胞。谱系重编程的出现同样是干细胞领域具有里程碑意义的重要事件。首先，由于不经过iPSCs的多能性阶段，谱系重编程避免了iPSCs的致畸胎瘤风险；其次，谱系重编程可以根据使用的转录因子和培养条件的不同直接获得终末成熟的功能细胞或者具有扩增能力的成体干细胞，而且得到的目的细胞类型相对均一；再次，谱系重编程也具有iPSCs的无免疫排斥及个体化的优势，因此在干细胞与再生医学研究和疾病治疗上显示出了更为广阔的应用前景[Sancho-MartinezI,BaekSH,IzpisuaBelmonteJC.Lineageconversionmethodologiesmeetthereprogrammingtoolbox.NatCellBiol.2012；14:892-9.]。最后，谱系重编程的出现极大的丰富了细胞命运转换和重编程理论的内涵，使人们对于细胞命运特化和调控的理解更为全面和深刻，并将这一概念应用到更为广阔的领域。从2008年首次实现在同一胚层内的胰腺外分泌细胞向内分泌β细胞的谱系重编程[ZhouQ,BrownJ,Kanare本文档来自技高网...

【技术保护点】
可将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合，所述小分子化合物选自TGF‑β信号通路、表观修饰剂、钙离子通道激动剂和代谢通路调节剂等功能群；代表性的含有8个小分子化合物的组合(8M)，包括FBP、Bay K 8644(Bay)、Bix01294((Bix)、SB431542(SB)或A83‑01(A83)、VPA、RG108(RG)、PD0325901和PS48中的全部或多个包括SB或A83在内的化合物的组合。

【技术特征摘要】
2016.06.03 CN 20161039130971.可将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合，所述小分子化合物选自TGF-β信号通路、表观修饰剂、钙离子通道激动剂和代谢通路调节剂等功能群；代表性的含有8个小分子化合物的组合(8M)，包括FBP、BayK8644(Bay)、Bix01294((Bix)、SB431542(SB)或A83-01(A83)、VPA、RG108(RG)、PD0325901和PS48中的全部或多个包括SB或A83在内的化合物的组合。2.根据权利要求1所述的小分子化合物组合，其特征在于：包括8个小分子化合物的组合为：SB43154：VPA：PD0325901：RG108：Bix01294：BayK8644：PS48：FBP按摩尔比为50：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的组合；或A83：VPA：PD0325901：RG108：Bix01294：BayK8644：PS48：FBP按摩尔比为12.5：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的组合。3.根据权利要求1所述的小分子化合物组合，其特征在于：包括4个小分子化合物的组合为：Bix01294(Bix)、BayK8644(Bay)、RG108(RG)和SB431542(SB)，简称BBRS组合，或A83-01(A83)、BayK8644(Bay)、RG108(RG)和SB431542(SB)，简称BBRA组合。4.根据权利要求3所述的小分子化合物组合，其特征在于：组合中各化合物使用浓度为：SB43152为(1～10μM)，A83为(0.4～1μM)，RG108为(0.01～1μM)，Bix01294为(0.1～2μM)，BayK8644为(1～4μM)。5.根据权利要求3或4所述的小分子化合物组合，其特征在于：BBRS组合为各化合物按SB：RG：Bix：Bay摩尔比50:1:12.5:50的组合，BBRA组合为各化合物按A83：RG：Bix：Bay摩尔比12.5:1:12.5:50的组合；优选各化合物使用浓度SB43152为2μM，A83为0.5μM，RG108为0.04M，Bix01294为0.5μM，BayK8644为2μM。6.一种可将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的重编程试剂盒，包括权利要求1至5任一所述小分子化合物组合以及化合物的使用说明书；各化合物分别包装，或按8M组合或BBRS组合或BBRA组合将各化合物混合后包装，说明书记载各化合物的使用浓度。7.根据权利要求6所述重编程试剂盒，其特征在于，还包括滋养层细胞及其使用说明，所述滋养层细胞为消化道来源的基质细胞，如胃肌成纤维细胞或小肠肌成纤维细胞。8.根据权利要求6或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王韫芳，王术勇，张文成，覃金华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11