两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法技术

本发明专利技术公开了属于人阴道上皮细胞培养技术范围的一种培养基联合序贯培养细胞的方法。即用无血清培养基＋含血清培养基的序贯培养，从而可以迅速使阴道上皮原代细胞大量增殖，传代成功率在８０％左右。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养技术范围，特别涉及。
技术介绍
由于国内尚无学者做过人的阴道上皮细胞的培养，所以我们申请了北京市科委的一项基金，作为关于人阴道上皮细胞模型建立和上皮细胞与白色念珠菌共培养实验的经费来源。实验采用了组织块法进行原代细胞培养，用角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)作为主要细胞培养基。但在实验中发现，K-SFM培养的原代细胞初期的生长速度慢，单纯K-SFM培养的阴道原代上皮细胞数量少，传代困难，所以传代成功率不高(约10％左右)，经常因为传代失败而无法获得大量细胞。查阅许多文献发现，国外进行组织块法的人阴道上皮细胞原代培养是用于永生化细胞系的研究，阴道上皮细胞数量要求不高，国内尚无这方面的研究，而我们的阴道上皮细胞与白色念珠菌共培养试验中需要大量细胞，所以在实验中发现了一种新方法，即，这种方法能使我们获得足够量的阴道上皮细胞。国外也有两种培养基联合运用培养上皮原代细胞的例子，但均为先是有血清培养基(2-7天)培养再到无血清培养基培养，与直接采用无血清培养基培养相似，阴道上皮细胞同样传代困难。而我们的方法是无血清培养基+含血清培养基的人阴道上皮原代细胞序贯培养，目前采用这种方法获取大量人阴道上皮细胞尚无报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。本实施方案是对人阴道上皮细胞的培养过程进行说明，普通培养过程如下(1)阴道上皮细胞的原代培养1.1 取材 1)阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织；2)子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除的患者的阴道组织；3)所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；4)术后病理均为良性疾病。1.2 从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有庆大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的4℃ D-Hank’s液(D-Hank’s液是按《细胞培养》介绍方法常规配制)的无血清培养基无菌小瓶内，(三种抗生素等量混合液与D-Hank’s液的体积比为1∶100)。1.3 消毒用上述1.2的加有抗生素的D-Hank’s液彻底清洗三遍。1.4 分离用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以减少成纤维细胞或其它细胞的污染。1.5 接种将上皮组织切成0.2～0.3厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内。1.6 培养将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入1.5ml两性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)(三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比均1∶100)，倒置3小时，在37℃浓度为5％的CO2培养箱中培养。1.7 换液3天后用上述1.6的无血清培养基进行第一次换液，之后每2-3天换液一次。2. 阴道上皮细胞的传代培养2.1 细胞生长汇合至85％-90％时，准备传代。2.2 吸除或倒掉瓶内旧培养液。2.3 向培养瓶内加入3ml D-Hank’s液，清洗细胞后倒掉。2.4 向培养瓶内加入1.5ml体积比浓度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司产品)和体积比浓度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司产品)等量混合的消化液。2.5 37℃消化3-6分钟。2.6 倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入1.5ml含体积比浓度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美国Hyclone公司产品)培养液终止消化，反复吹打瓶壁细胞，把液体收集入无菌离心管。2.7 800rpm离心3分钟。2.8 弃去上清，加入新鲜的含抗生素的无血清培养基(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，二者体积比为1∶1)，吹打成单细胞悬液，取一滴在血球计数板计数。2.9 按1∶2或1∶3进行传代。2.10 细胞传代后次日用上述2.8的无血清培养基进行换液，体外可传7-9代，但因为细胞数量少传代成功率低。在组织块培养过程中我们发现，单纯采用无血清培养基培养原代细胞时只有较少组织块有细胞爬出(这可能与手术中电刀操作、反复钳夹或术前阴道冲洗准备等损伤的原因有关)，而且K-SFM培养的原代细胞初期的生长速度慢，所以单纯K-SFM培养的阴道原代上皮细胞数量少，传代困难，所以传代成功率不高(约10％)，经常因为传代失败而无法获得大量细胞。本专利技术的有益效果不同于国外的上皮原代细胞培养两种培养基联合运用的例子，即先为有血清培养基(2-7天)再到无血清培养基，这与直接采用无血清培养基一样传代困难，阴道上皮原代细胞传代成功率只有10％左右。本申请的原代细胞无血清培养基(2周左右)、原代细胞有血清培养基(2周左右)然后再传代细胞无血清培养基的阴道上皮鳞状细胞培养方法，简单易行，而且成功率高，传代成功率达到80％左右。具体实施例方式本专利技术的目的是提供一种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法，人阴道上皮细胞培养的实验过程如下1.阴道上皮细胞的原代培养1.1取材1)阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织； 2)子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除的患者的阴道组织；3)所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；4)术后病理均为良性疾病。1.2从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有抗生素庆大霉素50μg/ml，青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的4℃D-Hank’s液(D-Hank’s液是按《细胞培养》介绍方法常规配制)的无血清培养基无菌小瓶内。1.3 消毒用上述1.2加有抗生素的D-Hank’s液彻底清洗三遍。1.4 分离用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以减少成纤维细胞或其它细胞的污染。1.5 接种将上皮组织切成0.2～0.3厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内。1.6 培养将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入1.5ml的两性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)(三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比均1∶100)，倒置3小时，在37℃浓度为5％的CO2培养箱中培养。1.7 换液3天后用上述1.6的无血清培养基进行第一次换液，之后每2-3天换液一次。1.8 培养2周左右取出组织块，往K-SFM中加入体积比浓度10％胎牛血清(美国GIBCO公司)继续培养约2周左右，原代细胞数量大大增加。2. 阴道上皮细胞的传代培养2.1 细胞生长汇合至85％-90％时，准备传代。2.2 吸除或倒掉瓶内旧培养液。2.3 向培养瓶内加入3ml D-Hank’s液，清洗细胞后倒掉。2.4 向培养瓶内加入1.5ml体积比浓度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司产品)和体积比浓度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司产品)等量混合的消化液。2.5 37℃消化3-6分钟。2.6 倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入1.5ml含体积比浓度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美国Hyclone公司产品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法，其特征在于：所述对人阴道上皮细胞的培养过程如下：（１）阴道上皮细胞的原代培养１．１取材：１）阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织；２）子宫肌瘤或子宫腺肌症 行全子宫切除的患者的阴道组织；３）所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；４）术后病理均为良性疾病；１．２从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有庆大霉素５０μｇ／ｍｌ、青霉素１０ ０Ｕ／ｍｌ和链霉素１００Ｕ／ｍｌ三种抗生素等量混合液的４℃Ｄ－Ｈａｎｋ′ｓ液的无血清培养基无菌小瓶内；１．３消毒：用上述１．２的加有抗生素的Ｄ－Ｈａｎｋ′ｓ液彻底清洗三遍；１．４分离：用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以 减少成纤维细胞或其它细胞的污染；１．５接种：将上皮组织切成０．２～０．３厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内；１．６培养：将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入１．５ｍｌ两性霉素Ｂ０．２５μｇ／ｍｌ、青霉素１００Ｕ／ｍｌ和链霉素１ ００Ｕ／ｍｌ三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ＳＦＭ，美国ＧＩＢＣＯ公司产品，编号１７００５－０４２），倒置３小时，在３７℃，体积比浓度为５％的ＣＯ↓［２］培养箱中培养；１．７换液：３天后用上述１ ．６的无血清培养基进行第一次换液，之后每２－３天换液一次；１．８培养２周左右取出组织块，往Ｋ－ＳＦＭ中加入体积比浓度１０％胎牛血清（美国ＧＩＢＣＯ公司）继续培养约２周左右，原代细胞数量大大增加；（２）阴道上皮细胞的传代培养　 　２．１细胞生长汇合至８５％－９０％时，准备传代；２．２吸除或倒掉瓶内旧培养液；２．３向培养瓶内加入３ｍｌＤ－Ｈａｎｋ′ｓ液，清洗细胞后倒掉；２．４向培养瓶内加入１．５ｍｌ体积比浓度０．１％的胰蛋白酶（Ｓｉｇ ｍａ公司产品）和体积比浓度０．０１％的乙二胺四乙酸（Ｓｉｇｍａ公司产品）等量混合的消化液；２．５３７℃消化３－６分钟；２．６倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入１．５ｍｌ含体积比浓度１０％胎牛 血清的ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品）培养液终止消化，反复吹打瓶壁细胞，把液体收集入无菌离心管；２．７８００ｒ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖秦平，吴文湘，杨慧霞，刘朝晖，张岱，余丽，
申请(专利权)人：廖秦平，吴文湘，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]