一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌制造技术

本发明专利技术公开了一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，属于微生物领域。本发明专利技术的嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)L3H9，已于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017250。该菌能在高盐和高精氨酸条件下高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸，具有降低环境中的氨基甲酸乙酯含量的潜力，在提高嗜盐四联球菌的工业应用性能以及发展酱油产业，控制或减少发酵体系中的氨基甲酸乙酯含量，提高发酵食品的安全性上有潜在应用价值。

A highly halophilic arginine producing bacterium that does not accumulate citrulline

The present invention discloses a kind of halophilic Staphylococcus with high efficiency of utilizing arginine without accumulation of citrulline, belonging to the field of microorganism. The present invention tetragenococcus halophilus (Tetragenococcus L3H9, halophilus) in May 9, 2017 is preserved in Chinese type culture collection center, Wuhan University Wuhan Chinese address for the preservation and the preservation number is CCTCC NO:M 2017250. The bacteria in high salt and arginine under the condition of efficient use of arginine and citrulline accumulation, can reduce the content of ethyl carbamate in the environment of the potential in improving the performance of tetragenococcus halophilus industrial application and development of soy sauce industry, control or reduction of ethyl carbamate in the fermentation system, improve the potential application of the safety of fermented foods.

【技术实现步骤摘要】
一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌
本专利技术涉及一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，属于微生物领域。
技术介绍
酱油是我国的传统发酵调味品，我国是酱油生产及出口大国。酱油是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用，经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。酱油中含有多种可溶性蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、醇类、酯类、有机酸以及丰富的维生素、无机盐等，营养价值十分丰富。氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate，简称EC)是发酵食品和酒精饮料生产过程中自然产生的副产物，具有致癌性和遗传毒性，能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。2007年4月10日，世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物，与丙烯酰胺同等危险。氨基甲酸乙酯的存在，给酱油带来了安全隐患，将使我国的酱油出口行业面临新的考验，影响我国的酱油出口经济，从而降低我国传统发酵文化的影响力。近年来，我国的重大食品安全问题屡有发生，食品安全关系到消费者的身体健康和生命安全，关系到社会稳定和国家信誉，从严控制及消除发酵制品中氨基甲酸乙酯含量是食品安全发展的必然趋势。在酱油生产前期，原料水解出大量精氨酸，这些精氨酸在一些乳酸菌和其他细菌的作用下，通过精氨酸脱亚氨基途径(Argininedeiminasepathway，简称ADI途径)被转化为瓜氨酸。有研究表明在高盐稀态酱油发酵过程中，氨基甲酸乙酯的前体物质是瓜氨酸和乙醇等。具体反应如下面的反应式所示：酱油发酵是一个食品混菌发酵体系，生产上不允许使用基因工程菌或用基因工程手段改造生产菌株。因此寻找来源于酱醪微生物体系可降解精氨酸且不积累瓜氨酸的菌株，通过强化这一菌株来降低酱油中的EC和其前体瓜氨酸，可为建立消除食品混菌发酵体系中的有害微生物代谢物的方法提供研究基础和理论支持。嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)是一种革兰氏阳性乳酸菌。主要存在于高盐或高糖环境中，存在于酱醪发酵中后期，是产生风味物质的主要微生物之一，可以应用于酱油行业。在前期研究中，专利技术人筛选得到的嗜盐四联球菌R23CCTCCNO:M2013480，拥有完整ADI途径，可以利用精氨酸且不积累瓜氨酸，是目前利用精氨酸与瓜氨酸能力最强的嗜盐四联球菌，但是其利用精氨酸和瓜氨酸的能力受精氨酸浓度、葡萄糖浓度及环境因素等影响较大。R23在3g/L以上精氨酸的环境中就表现为瓜氨酸积累，不能再消耗体系中的瓜氨酸，但在实际酱醪发酵环境中精氨酸浓度平均为5g/L，R23已不满足工业应用要求。表1嗜盐四联球菌R23及ATCC保藏嗜盐四联球菌利用精氨酸能力注：ΔArg为精氨酸消耗量；ΔCit为瓜氨酸积累量；ΔOrn为鸟氨酸生成量因此，筛选或者通过育种来获得精氨酸和瓜氨酸利用能力增强的菌株，以有效减少酱醪中的瓜氨酸含量，从而减少酱油中EC含量，并且提高酱油的风味，对于提高嗜盐四联球菌的工业应用性能以及发展酱油产业，控制或减少发酵体系中的EC含量，提高发酵食品的安全性具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一株在高盐和高精氨酸浓度下仍能高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，符合酱油生产环境要求，能有效降低酱油中氨基甲酸乙酯的含量。本专利技术提供了一株在高盐环境和高精氨酸环境下能够高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，本专利技术的嗜盐四联球菌L3H9，已于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2017250。在本专利技术的一种实施方式中，诱变原始菌株为嗜盐四联球菌BBER23。本专利技术第二个目的是提供一种所述嗜盐四联球菌的培养方法，所述方法是将嗜盐四联球菌接种至含NaCl的MRS培养基中，于30℃培养4-6天。本专利技术第三个目的是提供一种所述嗜盐四联球菌的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是将所述嗜盐四联球菌应用于降低发酵食品中瓜氨酸的含量。本专利技术第四个目的是提供所述嗜盐四联球菌在制备调味品中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括降低酱油中氨基甲酸乙酯含量。本专利技术的第五个目的是提供一种含有所述嗜盐四联球菌的微生物菌剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物菌剂能够用于发酵食品中。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物制剂为固态菌剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物制剂为液体菌剂。本专利技术的有益效果本专利技术的一株能高效利用环境中精氨酸和瓜氨酸的嗜盐四联球菌，耐盐，能在较高精氨酸浓度下消耗氨基甲酸乙酯的前体物瓜氨酸，从而降低环境中的氨基甲酸乙酯含量，在提高嗜盐四联球菌的工业应用性能以及发展酱油产业，控制或减少发酵体系中的EC含量，提高发酵食品的安全性上有潜在应用价值。本专利技术的嗜盐四联球菌是通过诱变育种的方法获得，不采用基因工程菌或用基因工程手段改造生产菌株，符合食品行业要求，同时也提高了菌株效能。生物材料保藏嗜盐四联球菌L3H9TetragenococcushalophilusL3H9，于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2017250。附图说明图1嗜盐四联球菌L3H9在不同温度下利用精氨酸能力分析。图2不同盐浓度下嗜盐四联球菌L3H9盐度耐受情况。具体实施方式氨基酸检测培养基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.05g/L，FeSO40.4g/L，柠檬酸三胺2g/L，CaCO30.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K2HPO42g/L，pH5.5。根据检测需要添加相应氨基酸。实施例1嗜盐四联球菌的诱变育种将嗜盐四联球菌R23接种至含100g/LNaCl的MRS液体培养基，30℃静置培养至对数生长期，离心后弃上清，用PBS缓冲液(pH7.0)清洗菌体2～3次后，向离心管中加入5mLPBS缓冲液悬浮菌体，然后分别进行紫外诱变和等离子诱变。(1)嗜盐四联球菌R23紫外诱变①取5mL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的培养皿上，在紫外光下进行紫外诱变，诱变时间分别为。置于15w紫外灯下30cm处，分别照射处理：60s、90s、120s，每个处理重复3次，每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30min。②将诱变后的菌悬液在黑暗中稀释至10-4、10-5倍，分别取0.1mL涂于平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。将涂匀的平板，置于30℃恒温培养箱中避光培养4d。③计算存活率，得出诱变致死曲线。将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。致死率(％)＝100－(处理后每0.2mL菌落数/对照每0.2mL菌落数)×100。④根据致死率，选择诱变时间为120s的处理条件下所得的突变株，进行高通量筛选。(2)嗜盐四联球菌R23等离子诱变①取10μL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用ARTP进行等离子诱变，在100W和10SLM的条件下诱变，诱变时间分别为3s、4s、5s。②将诱变后的菌悬液转移至装有1mL生理盐水的无菌管中，然后将样品稀释至1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，其分类学命名为嗜盐四联球菌L3H9Tetragenococcus halophilus L3H9，已于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017250。

【技术特征摘要】
1.一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，其分类学命名为嗜盐四联球菌L3H9TetragenococcushalophilusL3H9，已于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2017250。2.权利要求1所述嗜盐四联球菌的培养方法，其特征在于，所述方法是将嗜盐四联球菌接种至含NaCl的MRS培养基中，于30℃培养4-6天。3.权利要求1所述嗜盐四联球菌的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷庆子，方芳，王博，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32