Gal2转运蛋白的变体及它们的用途制造技术

本发明专利技术涉及多肽，所述多肽是包含对应于M435位置处的至少一种氨基酸取代以及可选的另外的氨基酸取代的Gal2变体。本发明专利技术进一步涉及编码多肽的核酸分子以及含有所述核酸分子的宿主细胞。本发明专利技术进一步涉及用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物的方法，包括优选在所述宿主细胞中表达所述核酸分子。本发明专利技术还涉及多肽、核酸分子或宿主细胞用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物，和/或用于含有戊糖、优选D‑木糖和/或L‑阿拉伯糖的生物材料的重组发酵的用途。

Variants of Gal2 transporters and their use

The present invention relates to polypeptides that contain Gal2 variants corresponding to at least one amino acid substitution corresponding to the M435 position, and optionally an additional amino acid substitution. The present invention further relates to nucleic acid molecules encoding polypeptides and to host cells containing the nucleic acid molecules. The invention further relates to a method for producing bioethanol and / or other biological based compounds, including preferably expressing the nucleic acid molecules in the host cell. The invention also relates to polypeptides, nucleic acid molecules or host cells for the production of bio ethanol and / or other biological compounds based on and / or use for fermentation of pentose, preferably containing recombinant D xylose and / or L Arabia sugar biological materials.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及多肽，所述多肽是包含在对应于M435位置处的至少一种氨基酸取代(atleastoneaminoacidsubstitution，至少一个氨基酸取代)和可选的另外的氨基酸取代的Gal2变体。本专利技术进一步涉及编码多肽的核酸分子以及涉及含有所述核酸分子的宿主细胞。本专利技术进一步涉及用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物(bio-basedcompound)的方法，包括优选在所述宿主细胞中表达所述核酸分子。本专利技术还涉及多肽、核酸分子或宿主细胞用于生产生物乙醇和/或其它基于生物的化合物和/或用于含有戊糖、优选D-木糖和/或L-阿拉伯糖的生物材料的重组发酵的用途。
技术介绍
由于其将糖发酵到乙醇和二氧化碳的特性，已经使用了啤酒、葡萄酒和面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)几个世纪，用于生产面包、葡萄酒和啤酒。在生物技术中，除异源蛋白的生产之外，酿酒酵母(S.cerevisiae)特别用于乙醇生产(用于工业目的)。在众多行业分支中乙醇用作合成的初始底物(initialsubstrate)。由于石油日益稀缺、油价上涨和全球对汽油的需求不断增加，乙醇作为替代燃料越来越重要。此外，酿酒酵母还用于生产其它生物燃料或有价值的生化化合物如异丁醇、琥珀酸、法呢烯/法呢烷(farnesen/farnesan)或青蒿素。为了使有利的价格和高效的生物燃料生产成为可能，含有木质纤维素如例如稻草、来自木材工业和农业的废物以及日常生活垃圾的有机组分的生物质的使用，自身呈现为初始底物。首先，所述生物质是非常方便的并且其次是大量存在的。木质纤维素的三种主要组分是木质素、纤维素和半纤维素。半纤维素，其是在纤维素之后的第二最常发生的聚合物，是高度支化的杂聚物。它由戊糖(L-阿拉伯糖、D-木糖)、糖醛酸(4-O-甲基-D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸)和己糖(D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖)组成。虽然半纤维素可以比纤维素更容易水解，但它含有戊糖L-阿拉伯糖和D-木糖，其通常不能由酵母酿酒酵母转化。为了能够将戊糖用于发酵，这些必须首先通过质膜进入细胞。虽然酿酒酵母不能代谢D-木糖或L-阿拉伯糖，但它可以将D-木糖或L-阿拉伯糖摄入细胞。然而，酿酒酵母不具有特异性转运蛋白(transporter)。借助于己糖转运蛋白来发生转运。然而，转运蛋白对D-木糖的亲和力是明显低于对D-葡萄糖的亲和力(Kotter和Ciriacy,1993)。在能够代谢D-木糖的酵母中，如例如毕赤酵母(P.stipitis)、休哈塔假丝酵母(C.shehatae)或嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)(DuPreez等人,1986)，存在非特异性低亲和力转运蛋白，其转运D-葡萄糖，以及仅用于D-木糖的特异性高亲和力质子同向转运体(Hahn-Hagerdal等人,2001)。在早期的实验中，发现了一些酵母，如例如热带假丝酵母(Candidatropicalis)、嗜鞣管囊酵母、毕赤酵母、休哈塔假丝酵母，其自然地使D-木糖或L-阿拉伯糖发酵或可以至少同化它。然而，这些酵母完全缺乏将L-阿拉伯糖和D-木糖发酵成乙醇的能力，或它们仅具有非常低的乙醇产率(Dien等人,1996)。此外，关于D-木糖和L-阿拉伯糖的摄取，知道的很少。在酵母休哈塔假丝中，假设质子同向转运(Lucas和Uden,1986)。在酿酒酵母中，依据半乳糖通透酶Gal2，已知它可以转运D-木糖，但还转运L-阿拉伯糖，其结构非常类似于D-半乳糖(Kou等人,1970)。大多数己糖转运蛋白可以介导D-木糖的摄取。近些年来，特别是连同木糖的发酵一起，描述了在酿酒酵母的生物技术修饰的酵母菌株中戊糖的乙醇发酵，其中尤其是酵母菌株毕赤酵母的各种基因用于酿酒酵母的遗传修饰。在这里工程特别集中于将来自毕赤酵母(木糖-发酵酵母)的用于初始木糖同化的基因引入酿酒酵母，即引入传统上用于从己糖进行乙醇生产的酵母(Jin等人2004)。Jeppson等人(2006)描述了通过酿酒酵母的木糖发酵，其中借助于引入木糖代谢途径，其类似于在自然使用木糖的酵母毕赤酵母和休哈塔假丝酵母中的木糖代谢途径，或类似于细菌代谢途径。Katahira等人(2006)描述了木质纤维素生物质如木屑的硫酸水解产物作为用于生产燃料生物乙醇的重要材料。在这项研究中，构建了重组酵母菌株，其能够使木糖和纤维寡糖发酵。为此，将各种基因整合至此酵母菌株中，并且也就是用于来自毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以及来自酿酒酵母的木酮糖激酶的细胞间表达，并且用于在细胞表面上来自棘孢曲霉(Aspergillusacleatus)的β-葡糖苷酶的呈递。在木屑的硫酸水解产物的发酵中，在36小时之后，重组菌株充分发酵了木糖和纤维寡糖。Pitkanen等人(2005)描述了获得和表征酿酒酵母菌株的木糖恒化器分离物(xylosechemostatisolate)，其过度表达编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的毕赤酵母的基因以及编码内源性木酮糖激酶的基因。分离物获得自需氧恒化器培养物，其中木糖作为单一或主要碳源。在需氧条件下并在具有30g/l木糖的基本培养基上，恒化器分离物的生长速率是原始菌株的生长速率的3倍高(与0.05h-1相比的0.15h-1)。木糖摄取率增加了几乎两倍。戊糖磷酸代谢途径的关键酶(转酮酶、转醛醇酶)的活性增加了两倍，同时相应降低了它们的底物(戊糖-5-磷酸酯、景天庚酮糖-7-磷酸酯)的浓度。Brat等人(2009)筛选了用于编码假定木糖异构酶的序列并终于能够在酿酒酵母中克隆并成功表达来自厌氧菌梭状芽孢杆菌(Clostridiumphytofermentans)的高活性新型的木糖异构酶的核酸数据库。这种酶的异源表达赋予酵母细胞代谢D-木糖并使用它作为唯一的碳源和能源的能力。Demeke等人(2013)开发了表达盒(expressioncassette)，其含有13种基因，包括菌梭状芽孢杆菌xylA，编码D-木糖异构酶，和戊糖磷酸途径的酶，并且以两份将上述盒插入工业酿酒酵母菌株乙醇红的基因组。随后的EMS诱变，在富含D-木糖的木质纤维素水解产物中的基因组混杂和选择，接着在含有D-木糖的复合培养基中的多轮进化工程，逐渐建立高效D-木糖发酵。Becker和Boles(2003)描述了酿酒酵母的实验室菌株的工程和选择，其能够将L-阿拉伯糖用于生长以及用于将它发酵成乙醇。这是可能的，这是因为细菌L-阿拉伯糖代谢途径的过度表达，由枯草芽孢杆菌AraA(BacillussubtilisAraA)以及大肠杆菌AraB和AraD组成，以及在酵母菌株中转运L-阿拉伯糖的酵母半乳糖通透酶的同时过度表达。所选菌株的分子分析表明使用L-阿拉伯糖的预先确定的先决条件是L-核酮糖激酶的较低活性。然而，除其他外，报道了来自这种酵母菌株的非常缓慢的生长。Wiedemann和Boles(2008)表明表达来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的L-阿拉伯糖异构酶以及来自大肠杆菌的L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-P4-差向异构酶的密码子优化的基因大大改善了L-阿拉伯糖转化率。Farwick等人(2014)开发了用本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽，包含在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的M435位置处的至少一种氨基酸取代，其中所述多肽与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％的序列同一性，并且其中所述多肽具有体外和/或体内戊糖转运功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.22 EP 14189927.81.多肽，包含在对应于SEQIDNO:1的氨基酸序列的M435位置处的至少一种氨基酸取代，其中所述多肽与所述SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少60％、或优选至少70％或80％或90％或95％的序列同一性，并且其中所述多肽具有体外和/或体内戊糖转运功能。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Gal2。3.根据权利要求1或2所述的多肽，包含氨基酸取代M435I。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，包含在对应于所述SEQIDNO:1的氨基酸序列的N376的一个或多个位置处的另外的一种或多种氨基酸取代。5.根据权利要求4所述的多肽，包含选自N376Y或N376F的一种或多种氨基酸取代。6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中，在对应于M435位置处的所述氨基酸取代与没有这种氨基酸取代的多肽相比，增加了所述体外和/或体内戊糖转运功能的活性。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中，在对应于M435位置处的所述氨基酸取代与没有这种氨基酸取代的多肽相比，增加了所述多肽对一种或多种戊糖的亲和力。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中，所述戊糖是D-木糖和/或L-阿拉伯糖。9.一种核酸分子，编码根据权利要求1至8中任一项所述的多肽。10.根据权利要求9所述的核酸分子，进一步包含载体核酸序列、优选表达载体序列，和/或包含启动子核酸序列和终止子核酸序列，和/或包含其它调控核酸序列和/或其中所述核酸分子包含dsDNA、ssDNA、PNA、CAN、RNA或mRNA或它们的组合。11.宿主细胞，包含根据权利要求9或10中任一项所述的核酸分子并且优选表达所述核酸分子，其中所述宿主细...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大·法尔维克，埃克哈德·博尔斯，弗吉尼娅·沙德韦格，费迪南德·基希纳，米斯拉夫·奥雷波，
申请(专利权)人：法兰克福大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE