用于非核糖体肽合成酶的组装和修饰的系统技术方案

本发明专利技术涉及用于非核糖体肽合成酶（NRPS）的组装和修饰的系统。该系统使用了包含缩合亚结构域的新颖的定义明确的构建基块（单元）。该策略允许有效地组合被称为交换单元（XU

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于非核糖体肽合成酶的组装和修饰的系统
本专利技术涉及用于非核糖体肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthase，NRPS)的组装和修饰的系统。该系统使用了包含缩合亚结构域的新颖的定义明确的构建基块(单元)。该策略允许有效地组合被称为交换单元(eXchangeUnit，XU2.0)的组装单元，而无需考虑其对后续NRPS腺苷酸化结构域的天然存在的特异性。本专利技术的系统允许容易地组装具有选择的任何氨基酸序列的NRPS，而没有由于天然存在的NRPS单元而引起的任何限制。该系统还允许使用创造性的XU2.0交换天然NRPS构建基块，从而产生经修饰的肽。本专利技术提供了所述系统、它们的单个交换单元、编码这些单元的核酸、及其方法和用途。描述非核糖体肽合成酶(NRPS)和聚酮化合物合成酶(PKS)是具有模块化结构的多功能酶复合物(Marahiel1997)。通过这些酶类别合成的许多天然产物具有医药和/或生物技术方面的意义，因为其具有与医学相关的特性，包括抗微生物(例如teixobactin)、抗肿瘤(例如bleomycin)、抗真菌(fengycin)和免疫抑制剂(cyclosporin)活性(Ling等，2015；Ishizuka等，1967；Loeffler等，1986；Emmel等，1989)。尽管由NRPS产生的肽化合物展现出广泛的生物活性和广泛的结构多样性(例如非蛋白氨基酸、N-甲基化、差向异构、杂环)，但共有通用的合成方式，即所谓的“多载体硫模板机制(multiple-carrierthiotemplatemechanism)”。NRPS的结构是专性模块化的。模块被定义为将一个特定的构建基块(例如氨基酸)整合入正在生长的肽链中的催化单元(Marahiel1997)。NRPS模块可以细分为多个结构域，每个结构域负责肽组装中的某个反应步骤。例如，规范的延伸模块由三个结构域组成，称为核心结构域：——腺苷酸化(adenylation，A)结构域，其选择性地确定底物(通常是氨基酸)并将其激活为氨酰基腺苷酸。——肽基载体蛋白(peptidylcarrierprotein，PCP)，也称为巯基化结构域(T)，其结合辅因子4-磷酸泛酰巯基乙胺，活化的氨基酸(AA)通过硫酯的形成与之共价结合。——缩合(condensation，C)结构域催化位于下游和上游的氨酰基或肽基残基之间的肽键形成。NRPS模块的第一个(N末端)模块(起始模块)通常不具有C结构域，而最后一个(C末端)模块(终止模块)通常包含硫酯酶(TE)结构域(Marahiel等，1997)。TE结构域通常负责释放线性(转移至水分子)、环状或支化环状肽(酰胺或酯键)。NRPS中可能包含以下结构域：C(缩合)、Cy(杂环化)、A(腺苷酸化)、T(巯基化)或PCP(肽基载体蛋白)、TE(硫酯酶)、E(epimerization，差向异构)、缩合/差向异构(C/E)、MT(甲基转移酶)、Ox(氧化酶)和Re(还原酶)结构域。NRPS通常具有以下结构：A-T-(C-A-T)n-C-A-T-TE，其中A-T是起始模块，C-A-T是延伸模块，C-A-T-TE是终止模块。在各个模块中，例如，可能发生以下变化：用Cy或C/E替换C，并插入E、MT、Ox或Re；用C或Re替换TE。完整的组装线可以具有起始模块、终止模块、以及在零个和n-2个之间的延伸模块，其中n是聚合物产物中单体的数量。该规则可能存在例外；例如，肠杆菌素合成酶，其中TE结构域充当寡聚酶，因此尽管它只有两个模块，但它会将这些二聚体产物中的三个钩在一起形成六聚体肽产物。NRPS通常是模块化的，并且一系列催化步骤从组成NRPS的每个多肽的氨基末端移动到羧基末端。例如，产生短杆菌酪肽(tyrocidine)的NRPS由产生三个多肽的三个基因组成。TycA包含起始模块；TycB包含三个延伸模块，而TycC包含六个额外的延伸模块加上终止模块。PKS中可能包含以下结构域：KS(酮合成酶)、AT(酰基转移酶)、T(巯基化)、KR(酮还原酶)、DH(脱水酶)、ER(烯酰还原酶)、TE(硫酯酶)。PKS通常具有以下结构：AT-T-(KS-AT-T)n-TE。AT-T是起始模块，KS-AT-T是延伸模块，TE是终止模块。PKS的结构与NRPS结构非常相似。混合的PKS-NRPS系统有许多示例(例如耶尔森菌素、埃博霉素、博来霉素)，其中两种类型的组装线拼在一起形成连贯的单元。在每个PKS模块中，要么找到KR、KR和DH、KR和DH和ER，要么找不到其他结构域。模块内的这些额外结构域决定了β碳(例如羰基、羟基、烯烃或饱和碳)处的化学官能度。NRP和PK作为潜在药物的力量在于其多样化和复杂的化学结构。通常，正是这些天然产物的复杂性使得它们(或其变体)难以合成获得。对于NRP或PK，已经开发出费力的合成路线的几个例子，少有成功。另外，此类分子上的各种部分无法通过有机合成进行修饰，或只能使用此类技术以低收率生产。NRP和PK天然产物难以合成和修饰，这凸显了对替代策略的需求，以增强合成和创建这些分子的变体。尽管NRPS具有明显的模块化结构，但是在专利技术人之前的专利技术(EP15002340)和本专利技术之前，它实际上很难交换结构域使得生成的NRPS是有效的。将一个或多个结构域或模块替代为另一个结构域或模块通常导致低产率(例如降低>10倍)，并产生不希望的生物合成副产物。这些变化可能是蛋白-蛋白相互作用中断的结果，也可能是由于C和TE结构域各自的底物特异性所致。因此，需要产生新的NRP和PK的新方法，并且需要增加此类NRP和PK的产率的方法。有关NRPS和PKS的更多常规信息，请参见Cane等(1998)、Marahiel(1997)、Sieber和Marahiel(2005)、Smith和Tsai(2007)以及Süssmuth和Mainz(2017)。在通过A-T双结构域起始模块激活第一个AA并与其进行共价结合后，肽的延伸通过随后与下游(C末端)延伸模块(C-A-T)n的T结构域共价连接的构件基块缩合而进行(Sieber和Marahiel，2005；或Süssmuth和Mainz，2017)。所有延伸反应(肽和酰胺键的形成)均由位于上游T和下游A结构域之间的约450个AA长的C结构域介导，并且严格单向导致NRPS产物的下游定向合成(Samel等，2007)。C结构域以其在上游T结构域结合的供体AA或肽的活化硫酯上的游离α-氨基催化下游T结构域结合的受体AA的亲核攻击。C结构域的生化表征揭示了其催化作用和底物特异性的见解。通过删除实验，Stachelhaus及其同事(1998年)发现C结构域对于肽键的形成是必不可少的。此外，几个C结构域的序列比对揭示了高度保守的HHXXXDG序列基序(所谓的“His基序”)，其也存在于酰基转移酶(例如氯霉素乙酰基转移酶)、NRPSE、以及Cy结构域中(DeCrecy-Lagard等，1995)。保守基序中第二个His残基的突变消除了缩合测试中的活性(Sie本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产非核糖体肽合成酶（NRPS）的系统，其中所述系统包括至少一个（优选两个）NRPS交换单元（XU

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180115 EP 18151588.31.一种用于生产非核糖体肽合成酶（NRPS）的系统，其中所述系统包括至少一个（优选两个）NRPS交换单元（XU2.0），每个所述交换单元都对用于组装NRPS的不同或相同的氨基酸X具有特异性，并且其中所述XU2.0包含至少一个部分缩合（C）结构域或部分缩合/差向异构（C/E）结构域，该结构域选自：对给定的氨基酸X具有特异性的缩合结构域受体位点亚结构域（CAsub）、对给定的氨基酸X具有特异性的缩合/差向异构结构域受体位点亚结构域（C/EAsub）、对给定的氨基酸X具有特异性的缩合结构域供体位点亚结构域（CDsub）、以及对给定的氨基酸X具有特异性的缩合/差向异构结构域供体位点亚结构域（C/EDsub）。


2.根据权利要求1所述的系统，其中至少一个XU2.0包含被除C或C/E结构域以外的一个或多个NRPS结构域隔开的C或C/E受体结构域和C或C/E供体结构域。


3.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述系统的至少第一XU2.0和第二XU2.0在彼此连接时形成由所述第一XU2.0的一个部分C或C/E结构域和所述第二XU2.0的一个部分C或C/E结构域组成的功能性组装的C或C/E结构域。


4.根据权利要求1至3的任一项所述的系统，其包含至少两个XU2.0，其每个都具有不同的氨基酸特异性X，优选地其中每个X选自对任何一个或两个、三个、四个或更多个天然或非天然氨基酸的特异性。


5.根据权利要求1至7的任一项所述的系统，所述系统进一步包括XU2.0终止和/或起始单元，其中所述XU2.0起始单元仅包含C或C/E结构域供体亚结构域作为开始单元，该亚结构域具有专门用于掺入酰基单元（脂肪酸及其衍生物）的结构域结构C-AX-T-CDsubX或C-AX-T-C/EDsubX，并且其中终止模块包括以下中的任何一个：末端缩合结构域（Cterm）、内部缩合（C）结构域、内部缩合和差向异构（C/E）双结构域、环化（Cy）结构域、差向异构（E）结构域、还原（Re）、氧化（Ox）或硫酯酶（TE）结构域。


6.根据权利要求1至7的任一项所述的系统，所述系统进一步包括XU2.0起始单元，该起始单元优选地选自下式：CAsub-AX-T-CDsubX、C/EAsub-AX-T-CDsubX、CAsub-AX-T-C/EDsubX、或C/EAsub-AX-T-C/EDsubX。


7.根据权利要求1至9的任一项所述的系统，其中至少两个、优选三个、四个或、更多个XU2.0当放入序列中时提供NRPS。


8.根据权利要求1至7的任一项所述的系统，其进一步包括至少一个具有修饰结构域的XU2.，所述修饰结构域例如是E、MT或Ox或其他修饰结构域。
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【专利技术属性】
技术研发人员：凯南·波祖尤克，安娜贝尔·林克，海尔格·波特，
申请(专利权)人：法兰克福大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE