用于非核糖体肽合成酶和聚酮合成酶的适配器系统技术方案

本发明专利技术涉及用于表达非核糖体肽合成酶（NRPS）、聚酮合成酶（PKS）或NRPS/PKS杂合合成酶的系统。NRPS、PKS或它们的杂合体是大型多结构域蛋白质或多结构域复合物，其用于生产肽的表达通常会造成困难。因此，本发明专利技术涉及用于表达酶片段的系统，所述酶片段可以通过特异性引入的蛋白质

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于非核糖体肽合成酶和聚酮合成酶的适配器系统


[0001]本专利技术涉及用于表达非核糖体肽合成酶（nichtribosomale Peptidsynthetasen，NRPS）、聚酮合成酶（Polyketidsynthasen，PKS）或NRPS/PKS杂合合成酶的系统。NRPS、PKS或它们的杂合体是大型多结构域蛋白质或多结构域复合物，其用于生产肽的表达通常会造成困难。因此，本专利技术涉及用于表达酶片段的系统，所述酶片段可以通过特异性引入的蛋白质
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蛋白质相互作用在翻译后组装而形成功能性多酶复合物。本专利技术公开了这种组件的蛋白质片段以及它们的编码核酸。还公开了本专利技术蛋白质片段的载体系统及其用于制备功能性NRPS/PKS酶复合物的用途。
[0002]说明非核糖体肽（NRP）是由非核糖体肽合成酶（NRPS）产生的肽，具有很大的结构多样性，其特征尤其是环状的、分支的或其他复杂的一级结构（Caradec et al., 2014；Caboche et al., 2010）。由于其结构复杂性，其中许多分子表现出治疗特性，包括抗生素、免疫抑制或抗癌作用模式（Finking und Marahiel, 2004；Felnagle et al., 2008）。因此，它们不仅是新药物的来源，而且用作药物试剂的基本结构（Cane et al., 1998）。为此，天然物质通常通过半合成进行化学修饰，半合成是一种结合生物合成和有机合成的过程（Kirschning und Hahn, 2012）。或者，也可以通过重新编程负责合成的NRPS来产生新的NRP。为此，合成酶的模块化结构经常被开发和基因改造。文献中已知一些成功重新编程NRPS的例子（Schneider et al., 1998；Chiocchini et al., 2006）。然而，这些合成酶的生产率通常受到严重限制（Suo, 2005）。
[0003]NRP的结构和功能多样性是D
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氨基酸（Aminos
ä
uren，AS）、杂环元素或N
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甲基化侧链以及添加脂肪、糖和卤素的结果（Hur et al., 2012）。具有这种结构特性的NRP的例子例如是带有杂环的杆菌肽和弧菌素，或特征在于掺入D
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AS的环孢菌素A和短杆菌素A。另一方面，达托霉素是一种乙酰化肽，由于其脂肪酸，具有很强的抗菌作用；而Balhimycin和丁香霉素是卤代NRP的例子，具有抗菌和抗真菌特性。
[0004]SYNZIP是异种特异性合成卷曲螺旋（coiled coil），可实现受控的蛋白质相互作用，并用于合成生物学。卷曲螺旋通常由两个、三个或四个两亲的20
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50个AS长的α螺旋组成，它们形成交织在一起的左手超螺旋。它们是许多蛋白质的结构基序，并且也出现在例如人类bZIP转录因子的亮氨酸拉链区域中。卷曲螺旋的特征在于七联体模式(abcdefg)
n
，其在位置a和d处带有疏水性AS，而静电AS通常出现在位置e和g处。在α
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螺旋二级结构中，这些疏水性AS彼此相互作用并形成狭窄的疏水界面（Lumb et al., 1994）。
[0005]SYNZIP最初是为与人类bZIP转录因子（TF）的亮氨酸拉链区域的异种特异性相互作用而开发的。为此，基于计算机构建了48种人工肽，随后研究了它们与这些肽的相互作用（Grigoryan et al., 2009）。另一方面，在进一步的研究中，还测试了这些肽与彼此的相互作用。为此，Reinke等人进行了蛋白质微阵列测定，其中对所有48种人工卷曲螺旋以及7种进一步的人类bZIP的卷曲螺旋进行了相互测试（图1）。从测定结果中，选择了27对（23种合成的（即SYNZIP 1
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23）和3种人类bZIP结构），它们显示出强烈的异种特异性相互作用，并同
时显示出低同种特异性相互作用。如图1A所示，肽参与至少1到最多7种相互作用，并且在某些情况下可以形成不同的网络（图1B）。这些的示例是线性、环形、分支和正交网络（Thompson et al., 2012）。此外，从a
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a'位置上的Asn
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Asn配对得出的结论是，大多数配对必须是平行异二聚体（Reinke et al., 2010）。
[0006]国际公开号WO 2019/138117描述了一种用于组装和修饰NRPS的系统。该系统使用新颖的、精确定义的构建块（单元），其中包含缩合子结构域。这种策略能够有效组合称为交换单元（eXchange Unit，XU2.0）的组件，而不管它们对随后的NRPS腺苷酸化结构域的自然发生特异性如何。WO 2019/138117的系统能够简单地组装具有合成具有任何氨基酸序列的肽的活性的NRPS，而不受天然存在的NRPS单元的限制。该系统还使得可以用根据本专利技术的XU2.0交换天然NRPS构建块，由此产生修饰的肽。尽管该系统允许XU2.0单元的简单组合，但它仍然需要在开放阅读框（ORF）中表达组装的NRPS蛋白。这会导致问题，尤其是在NRP较长的情况下。
[0007]因此，本专利技术的目的是生产NRPS模块或子模块（或结构域），例如来自WO 2019/138117的XU2.0单元，其是高效且灵活地重组的。
[0008]专利技术简述一般而言，通过简要描述，本专利技术的主要方面可以描述如下：在第一方面，本专利技术涉及一种蛋白质或蛋白质片段，其至少包含非核糖体肽合成酶（NRPS）、聚酮合成酶（PKS）或NRPS/PKS杂合合成酶的第一结构域或部分结构域（第一PKS
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NRPS结构域），其中所述蛋白质或蛋白质片段具有包含第一结合结构域的N末端或C末端，并且其中该第一结合结构域优选分别代表所述蛋白质或蛋白质片段的N末端或C末端，并且其中所述第一结合结构域的特征在于能够与至少一个相应的第二结合结构域进入特异性蛋白质
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蛋白质结合的特性。
[0009]在第二方面，本专利技术涉及一种分离的核酸构建体，其包含第一编码区，该第一编码区具有编码第一方面的蛋白质或蛋白质片段的核酸序列。
[0010]在第三方面，本专利技术涉及一种用于产生功能性NRPS或PKS的载体系统，其中所述载体系统包含至少一个根据第二方面的核酸构建体，并且其中所述至少一个核酸构建体适合于表达至少两种根据第一方面的蛋白质或蛋白质片段，并且其中所述至少两种蛋白质或蛋白质片段是不同的并且一起形成功能性NRPS、PKS或NRPS/PKS杂合体。
[0011]在第四方面，本专利技术涉及一种用于产生功能性（完整）NRPS或PKS的方法，包括至少使根据第一方面的第一蛋白质或蛋白质片段与根据第一方面的第二蛋白质或蛋白质片段接触，其中第一蛋白质或蛋白质片段具有末端第一结合结构域，并且其中第二蛋白质或蛋白质片段具有末端第二结合结构域而非末端第一结合结构域。
[0012]专利技术详述本专利技术的元素如下所述。这些元素通过具体实施方案进行描述。然而，不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种蛋白质或蛋白质片段，其至少包含非核糖体肽合成酶（NRPS）、聚酮合成酶（PKS）或NRPS/PKS杂合合成酶的第一结构域或部分结构域（第一PKS
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NRPS结构域），其中所述蛋白质或蛋白质片段具有包含第一结合结构域的N末端或C末端，并且其中该第一结合结构域优选分别代表所述蛋白质或蛋白质片段的N末端或C末端，并且其中所述第一结合结构域的特征在于能够与至少一个相应的第二结合结构域进入特异性蛋白质
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蛋白质结合的特性。2.根据权利要求1所述的蛋白质或蛋白质片段，其进一步包含至少一个、优选两个、三个或四个或更多个另外的PKS
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NRPS结构域，其中所述另外的PKS
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NRPS结构域以直接功能排列的方式排列在所述第一PKS
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NRPS结构域旁边。3.根据权利要求1或2中任一项所述的蛋白质或蛋白质片段，其中所述第一PKS
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NRPS结构域或部分结构域选自A结构域、C结构域、C/E结构域、E结构域、C
start
结构域、FT结构域、或T结构域。4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质或蛋白质片段，其至少包含A结构域、C结构域和T结构域，优选地其中所述蛋白质或蛋白质片段具有至少一个NRPS
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PKS延伸模块、起始模块或终止模块。5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质或蛋白质片段，其中所述结合结构域包含合成卷曲螺旋结构域（SYNZIP），优选其中所述SYNZIP选自1
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23 SYNZIP。6.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质或蛋白质片段，其中与所述第一结合结构域相反的末端包含第三结合结构域，并且其中所述第三结合结构域的特征在于能够与至少一个相应的第四结合结构域进入特异性蛋白质
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蛋白质结合的特性。7.根据权利要求6所述的蛋白质或蛋白质片段，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赫尔格，
申请(专利权)人：法兰克福大学，
类型：发明
国别省市：