一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了枯草芽孢杆菌在制备耐高温的类胡萝卜素降解酶，和/或，在烟草发酵中的应用，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。本申请公开了枯草芽胞杆菌CICC24406能够产生高酶活性的类胡萝卜素降解酶，为类胡萝卜素降解酶的生产来源提供了一个新的途径。该类胡萝卜素降解酶粗酶液降解效率可达到70％以上，且在80℃高温环境下能有效加速类胡萝卜素的降解，打破了高温对普通类胡萝卜素降解酶的限制，为高温工艺提供了一种新的类胡萝卜素降解酶。该酶可降解类胡萝卜素生成致香物质应用于烟草产品中。解类胡萝卜素生成致香物质应用于烟草产品中。解类胡萝卜素生成致香物质应用于烟草产品中。

A high temperature resistant carotenoid degrading enzyme and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及微生物发酵
，尤其涉及一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其方法和应用。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素(Carotenoids)普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中，主要包括β
‑
胡萝卜素和γ
‑
胡萝卜素，是一类重要的香味前体物质；类胡萝卜素通过酶催化、光氧化可形成β
‑
紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等降异戊二烯类化合物(norisoprenoids)，该类物质不仅均具有良好的风味，而且具有较低的嗅觉阈值，是食品、烟草化妆品等加工行业的重要香料物质，可有效提升食品、化妆品、烟叶制品香气品质；由于从植物中直接提取上述香气物质，存在着其工序繁琐、成本高且含量极低的缺点，故，利用类胡萝卜素降解生成香气物质已经成为近年来食品、烟草等学科的研究热点之一。目前，类胡萝卜素的降解方式主要有物理热降解、化学降解和生物酶催化降解方法，其中物理热降解需高温处理，不利于实际生产应用；化学降解过程中的化学试剂难去除，且有的对人体有害；另外，上述两种降解方法都存在降解产物难以控制、产生的目标产物含量低等缺点；而生物酶催化降解具有降解效率高、专一性强、催化条件温和、产物中目标化合物含量高、不使用有害的化学试剂的特点，近年来越来越受到关注，筛选类胡萝卜素降解菌株，制备类胡萝卜素的降解酶，是实现类胡萝卜素高效降解，获得致香物质等香气物质的前提。且目前类胡萝卜素降解酶存在无法在高温条件中使用的问题，限制了其应用的场景。
[0003]枯草芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一种，广泛分布在自然界中，是一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种，被广泛应用于农业、工业、食品、畜牧、水产等行业，具有良好的应用前景。目前，有关枯草芽孢杆菌生产α
‑
淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶应用研究方面报道较多，但在枯草芽孢杆菌生产类胡萝卜素降解酶方面未见报道。
[0004]烟叶发酵是在一定的温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化，将不利于烟叶品质的大分子物质组分(包括蛋白质、淀粉、果胶等)降解转化成有利于提升烟叶品质的小分子组分(还原糖、氨基酸等)，进而达到克服新烟不良品质，改良和提高烟叶内在质量与外观质量的一种初加工方法，是卷烟加工中极为重要的一个环节。目前，烟叶发酵主要采用自然发酵与人工发酵；其中，自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，利用春季季节性温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的，人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法；但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种耐高温类胡萝卜素降解酶及其方法和应用，该降解酶采用枯草芽孢杆菌制备获得，其降解效率可以达到70％以上，其发酵温度可达到90℃。
[0006]一方面，本申请提供了枯草芽孢杆菌在制备耐高温的类胡萝卜素降解酶，和/或，
在烟草发酵中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0007]另一方面，本申请还提供了一种利用上述的枯草芽孢杆菌制备类胡萝卜素降解酶的方法，所述方法包括：向发酵培养基中接种所述枯草芽孢杆菌进行发酵，离心获得上清液，即获得所述类胡萝卜素降解酶的粗酶液。
[0008]进一步的，所述发酵温度为25℃～30℃，转速为100～200r/min，培养时间为60～96h；优选的，发酵温度为28℃，转速为160r/min，培养时间为72h。
[0009]进一步的，所述发酵培养基的组成包括：糖、亚硝酸钠、酵母粉；
[0010]优选的，所述糖选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉中的一种或多种；更优选的，所述糖为甘露醇；
[0011]更优选的，按质量百分比计，所述发酵培养基组成包括：1％～5％糖、0.1％～0.5％亚硝酸钠和0.2％～0.6％酵母粉；优选的，所述发酵培养基组成为2％糖、0.2％亚硝酸钠和0.4％酵母粉。
[0012]在一种优选的实施方式中，枯草芽孢杆菌CICC24406菌株发酵产类胡萝卜素降解酶最适培养基配方为：K2HPO
4 1.0g，MgSO
4 0.5g，NaNO
2 2.0g，FeSO4·
7H2O 0.01g，KCl 0.5g，甘露醇20.0g，酵母粉4.0g，水1000mL。
[0013]在一种优选的实施方式中，上述降解酶的制备方法，包括如下步骤：
[0014]步骤一、将枯草芽胞杆菌CICC24406接种于LB斜面培养基，30℃活化培养48h；
[0015]步骤二、将枯草芽胞杆菌CICC24406新鲜斜面培养物接种于优化后的改良察氏β
‑
胡萝卜素液体培养基中，在28℃，160r/min条件下，培养72h，获得发酵液；
[0016]步骤三、将上述发酵液在4℃，10000r/min离心20min，取上清液过0.22μm微孔滤膜即得粗酶液。
[0017]优化后的改良察氏β
‑
胡萝卜素液体培养基等同于上述发酵培养基。
[0018]另一方面，本申请还提供了采用枯草芽孢杆菌发酵获得的类胡萝卜素降解酶，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心；优选的，所述类胡萝卜素降解酶的酶促作用温度为20℃～90℃，pH为4～6；更优选的，温度为80℃，pH为5。
[0019]另一方面，本申请还提供了上述的类胡萝卜素降解酶在制备类胡萝卜素致香物质中的应用；优选的，所述类胡萝卜素致香物质包括1
‑
甲基
‑
2,3
‑
环己二酮、氧化异佛尔酮、β
‑
紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯。
[0020]本申请粗酶液对β
‑
胡萝卜素降解产物12种，均为类胡萝卜素C9
‑
C10/C9
’‑
C10
’
和C7
‑
C8/C7
’‑
C8
’
双键位置降解而生成的C13衍生物等香气物质。其中主要降解产物为1
‑
甲基
‑
2,3
‑
环己二酮、氧化异佛尔酮、β
‑
紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯，该类物质具有清凉和优雅的果香、水果的香气、花香、蜜甜的木香和干果香等香气，是食品、烟叶制品、化妆品等行业中常用单体香料，在食品、化妆品、烟叶制品香韵调和时广泛使用。
[0021]另一方面，本申请还提供了一种利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌在制备耐高温的类胡萝卜素降解酶，和/或，在烟草发酵中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)CICC24406，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。2.一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备类胡萝卜素降解酶的方法，其特征在于，所述方法包括：向发酵培养基中接种所述枯草芽孢杆菌进行发酵，离心获得上清液，即获得所述类胡萝卜素降解酶的粗酶液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为25℃～30℃，转速为100～200r/min，培养时间为60～96h；优选的，发酵温度为28℃，转速为160r/min，培养时间为72h。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：糖、亚硝酸钠、酵母粉；优选的，所述糖选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉中的一种或多种；更优选的，所述糖为甘露醇；更优选的，按质量百分比计，所述发酵培养基组成包括：1％～5％糖、0.1％～0.5％亚硝酸钠和0.2％～0.6％酵母粉；优选的，所述发酵培养基组成为2％糖、0.2％亚硝酸钠和0.4％酵母粉。5.采用枯草芽孢杆菌发酵获得的类胡萝卜素降解酶，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subt...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝捷，张善林，云晶，于涛，费玥，李力群，李剑梅，柴林山，朱万芹，张疏雨，谢存一，
申请(专利权)人：内蒙古昆明卷烟有限责任公司，
类型：发明
国别省市：