可调控启动子制造技术

一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤：a)用阻遏所述启动子的基础碳源培养所述细胞系，b)用使所述启动子去阻遏的有限量的补充碳源培养所述细胞系，从而诱导POI以相比于天然pGAP启动子至少15％的转录速率产生，和c)产生并回收所述POI；以及另外地，分离的可调控的启动子和相应的表达系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可调fe启动子专利
本专利技术涉及可调控启动子和在真核细胞培养中在可调控启动子的控制下产生感兴趣蛋白质的方法。专利技术背景 已使用真核宿主实现重组蛋白质的成功产生。最突出的例子是酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、丝状真菌如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichoderma reesei)、或哺乳动物细胞如例如CHO细胞。尽管容易以高比率实现一些蛋白质的产生，但还有许多其他蛋白质仅在相当低的水平获得。基因在宿主生物体中的异源表达通常需要允许稳定转化宿主生物体的载体。载体会提供基因和临近编码序列5’端的功能性启动子。由此，转录由该启动子序列调控和启动。迄今使用的大多数启动子源自编码通常以高浓度存在于细胞中的蛋白质的基因。EP0103409A2披露了使用与糖酵解途径中特定酶的表达有关的酵母启动子，即牵涉丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘油酸变位酶、己糖激酶I和2、葡糖激酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶和糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤：a)用阻遏所述启动子的基础碳源基础碳源培养所述细胞系，b)用使所述启动子去阻遏的无补充碳源的条件或有有限量补充碳源的条件培养所述细胞系，从而诱导以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少15％的转录速率产生所述POI，并c)产生并回收所述POI。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.07 EP 11184323.1;2012.06.06 EP 12171006.5;1.一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤: a)用阻遏所述启动子的基础碳源基础碳源培养所述细胞系， b)用使所述启动子去阻遏的无补充碳源的条件或有有限量补充碳源的条件培养所述细胞系，从而诱导以相比于所述细胞的天然PGAP启动子至少15%的转录速率产生所述POI，并 c)产生并回收所述POI。2.依照权利要求1的方法，其中所述基础碳源基础碳源选自下组:葡萄糖、甘油、乙醇、其混合物、和复合营养材料。3.依照权利要求1或2的方法，其中所述补充碳源是诸如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖等己糖，诸如蔗糖等二糖，诸如甘油或乙醇等醇，或其混合物。4.依照权利要求1至3中任一项的方法，其中所述步骤b)采用不提供或提供有限量的所述补充碳源的补料培养基，优选所述有限量为所述培养基中0-lg/L。5.依照权利要求1至4中任一项的方法，其中所述有限量的补充碳源为生长限制性的，以保持特定生长速率在0.021h-1至0.21h-1，优选0.021h-1至0.151h-1内。6.依照权利要求1至5中任一项的方法，其中所述启动子能控制野生型真核细胞中基因的转录，该基因选自下组 :G1 (SEQ ID7)、G3(SEQ ID8)、G4(SEQ ID9)、G6(SEQ ID10)、G7(SEQID11)和G8 (SEQ ID12)、或其功能活性变体。7.依照权利要求6的方法，其中所述功能活性变体选自下组:具有至少约60%核苷酸序列同一性的同源物，通过在亲本核苷酸序列内或序列远端之一或两端处插入、缺失或取代一个或多个核苷酸而修饰得到的同源物，优选具有至少200bp的核苷酸序列，以及源自除巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)以外的物种的类似物。8.依照权利要求6或7的方法，其中所述pGl的功能活性变体选自下组:pGla(SEQID41)、pGlb(SEQ ID42)、pGlc(SEQ ID43)、pGld(SEQ ID44)、pGle(SEQ ID45)和 pGlf (SEQID46)。9.依照权利要求1至8中任一项的方法，其中所述细胞系选自下组:哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞系，优选为酵母。10.依照权利要求1至9中任一项的方法，其中所述POI为异源蛋白质，优选选自治疗性蛋白质包括抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质偶联物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子、或POI的代谢物。11.用于调控POI在重组真核细胞中在碳源可调控启动子的转录控制下表达的方法，所述启动子相比于所述细胞的天然PGAP启动子具有至少15%的转录强度，其中所述表达在限制所述碳源的条件下诱导。12.在重组真核细胞中在碳源可调控启动子的转录控制下产生POI的方法，其中所述启动子相比于所述细胞的天然pGAP启动子具有至少15%的转录强度。13.依照权利要求1至12中任一项的方法，其中所述可调控启动子包含选自下组的核酸序列:a)pGl(SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6(SEQ ID3)、pG7(SEQ ID5)、或pG8 (SEQID6)； b)与以下具有至少60% 同源性的序列:pGl (SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)...

【专利技术属性】
技术研发人员：D玛塔诺维克，B加瑟，M茂勒，R普里尔霍佛，J克雷恩，J温格，
申请(专利权)人：隆扎有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH