分析多个细胞和检测生物产品制造中的蛋白质序列变体的方法技术

公开了用于检测蛋白质序列变体和评估在生物产品制造中产生蛋白质序列变体的概率的方法。

Analysis of multiple cells and detection of protein sequence variants in biological product manufacturing

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析多个细胞和检测生物产品制造中的蛋白质序列变体的方法相关申请本申请要求于2017年2月3日提交的美国序列号62/454,567，2017年2月28日提交的美国序列号62/464,775和2017年5月24日提交的美国序列号62/510,559的优先权，其全部内容通过引用完整并入本文。专利
本公开涉及用于评估生物产品制造的各个阶段的蛋白质序列变体的发生的方法和系统。专利技术背景蛋白质序列变体(PSV)定义为非预期的氨基酸序列变化，其可以由于基因组核苷酸变化或翻译误掺入而发生。低水平序列变体促成产物异质性，其可影响产物功效和免疫原性。将序列变体系统筛选的方法结合到稳定的细胞系开发过程中对于成功制造生物药物是重要的。关于氨基酸序列变体可以出现的方式已经报道了几种潜在的机制，包括基因组DNA的突变、特定密码子的错译和营养物耗尽。序列变体的系统筛选正在成为用于成功制造生物药物的细胞系构建过程的完整分析组分。一种方法是使用扩增子测序，这是一种用于鉴定核酸中突变的灵敏性方法。然而，正确的DNA或RNA序列不能保证正确的蛋白质序列，并且已知翻译过程的错误率要高得多。通常认为翻译中的错误率(10-4-10-3)比转录中的错误率(10-5-10-4)高约1个数目级。由于上述原因，序列变体的分析在蛋白质水平上进行可以是重要的。用LC-MS进行的肽定位分析为蛋白质序列的深入表征提供了极好的特异性和灵敏性。可以通过MS2数据的从头分析来检测序列变体。方法的灵敏性依赖于为低丰度种类生成非常高质量的碎裂数据。此方法的缺点是高水平的假阳性。因此，需要改进的在生物药物制造的各个阶段对蛋白质产物变体的系统性评估。专利技术概述在一个方面，本专利技术的特征在于分析多个细胞、使用所述多个细胞的方法，或由所述多个细胞制备的多肽的方法，包括：a)培养多个细胞以制备包含产物的条件化培养基，所述多个细胞中的至少一个细胞包含编码产物的核酸序列，所述产物包含第一氨基酸序列；b)将来自所述包含产物的条件化培养基的第一多肽样品进行基于序列的第一反应以提供第一反应产物，例如蛋白水解片段(和任选地，例如对反应产物进行分离步骤，例如通过质谱法)；c)将所述第一反应产物的数值，例如存在、迁移率(例如飞行时间)或分子量与参考值，例如通过对参考序列，例如第一氨基酸序列应用基于序列的第一反应产生的反应产物的数值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析，例如测序；d)将来自包含产物的条件化培养基的第二多肽样品进行基于序列的第二反应，例如用第二蛋白水解酶的消化以提供第二反应产物，例如蛋白水解片段(和任选地例如对反应产物进行分离步骤，例如质谱法)；e)将所述第二反应产物的数值，例如存在、迁移率(例如飞行时间)或分子量与参考值，例如通过对参考序列，例如第一氨基酸序列应用基于序列的第二反应产生的反应产物的数值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析，例如测序；f)任选地，将来自包含产物的条件化培养基的第三多肽样品进行基于序列的第三反应，例如用蛋白水解酶的消化以提供第三反应产物，例如蛋白水解片段(和任选地例如对反应产物进行分离步骤，例如质谱法)；g)任选地，将所述第三反应产物的数值，例如存在、迁移率(例如飞行时间)或分子量与参考值，例如通过对参考序列，例如第一氨基酸序列应用基于序列的第三反应产生的反应产物的数值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析，例如测序；h)任选地，响应于c)和任选地e)和g)的结果，测定所述多个细胞中是否存在除所述第一氨基酸序列以外的序列，从而分析多个细胞，使用多个细胞的方法，或由多个细胞制备的多肽。另一方面，本专利技术的特征在于检测蛋白质序列变体的方法，所述方法包括：a)提供细胞群体，其中细胞产生蛋白质产物；b)从细胞群体中纯化蛋白质产物；c)制备纯化的蛋白质产物以进行质谱法分析；d)通过质谱法分析制备的纯化蛋白质产物；其中对于多个(例如，超过一个，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10个或更多)细胞群体平行或序贯重复a)-d)；并且e)通过比较来自多个细胞群体的质谱法数据和质谱法数据数据库来检测蛋白质序列变体，从而检测蛋白质序列变体。另一方面，本专利技术的特征在于分析多个细胞的方法，所述方法包括：a)培养多个细胞以制备包含产物的条件化培养基，所述多个细胞中的至少一个细胞包含编码产物的核酸序列，所述产物包含第一氨基酸序列；b)将来自所述包含产物的条件化培养基的第一多肽样品进行基于序列的第一反应以提供第一反应产物；c)将所述第一反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析；d)将来自包含产物的条件化培养基的第二多肽样品进行基于序列的第二反应以提供第二反应产物；e)将所述第二反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析；f)任选地，将来自包含产物的条件化培养基的第三多肽样品进行基于序列的第三反应以提供第三反应产物；g)任选地，将所述第三反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析，h)响应于c)和任选地e)和g)的结果，测定所述多个细胞中是否存在除所述第一氨基酸序列以外的序列，从而分析多个细胞。另一方面，本专利技术的特征在于检测蛋白质序列变体的方法，所述方法包括：a)从培养基中提供纯化的蛋白质产物，所述培养基包含细胞群体，例如多个细胞，其中所述细胞产生蛋白质产物；b)通过质谱法分析所述纯化的蛋白质产物；其中平行或序贯地对相同细胞群体或不同细胞群体内的多个样品重复a)-b)；并且c)通过比较来自所述多个样品的质谱法数据和质谱法数据的数据库来检测所述多个样品内的蛋白质序列变体，从而检测所述蛋白质序列变体。在一些实施方案中，样品是等分试样。另一方面，本专利技术的特征在于例如通过本文所述的任何方法制备的多肽，或通过本文所述任何方法的多个细胞或细胞群体制备的多肽。附图简述图1是蛋白质序列变体分析的工作流。图2显示了尿素摩尔浓度对用于利妥昔单抗消化的胰蛋白酶效率的影响。图3A显示了就曲妥珠单抗的缺少的切割肽的数目而言尿素摩尔浓度和温度对胰蛋白酶效率的影响。图3B以表格形式显示了相同的数据。图4显示了尿素摩尔浓度和温度对GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK肽消化效率的影响。图5显示了尿素摩尔浓度对用于利妥昔单抗消化的胰凝乳蛋白酶活性的影响。图6A显示了尿素摩尔浓度和温度对使用胰凝乳蛋白酶对曲妥珠单抗的不完全消化的影响。图6B是显示图6A的数据的表。图7显示了在2M尿素中于37℃和0.5M尿素中于25℃的尿素摩尔浓度和温度对曲妥珠单抗的胰凝乳蛋白酶消化效率的影响。图8显示了尿素摩尔浓度对用于利妥昔单抗消化的AspN效率的影响。图9显示了尿素摩尔浓度对用于cB72.3消化的AspN效率的影响。图10是在用OrbitrapFusion的nanoLC-MS2分析的情况下曲妥珠单抗HC区的组合胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化的覆盖图。在重链(红色圆圈)中未检测到1个三肽和1个单残基肽。图11是在用OrbitrapFusion的nanoLC-MS2分析的情况下曲妥珠单抗HC区的组合胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶/l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分析多个细胞的方法，所述方法包括：a)培养多个细胞以制备包含产物的条件化培养基，所述多个细胞中的至少一个细胞包含编码产物的核酸序列，所述产物包含第一氨基酸序列；b)将来自所述包含产物的条件化培养基的第一多肽样品进行基于序列的第一反应以提供第一反应产物；c)将所述第一反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析；d)将来自包含产物的条件化培养基的第二多肽样品进行基于序列的第二反应以提供第二反应产物；e)将所述第二反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析；f)任选地，将来自包含产物的条件化培养基的第三多肽样品进行基于序列的第三反应以提供第三反应产物；g)任选地，将所述第三反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析，h)响应于c)和任选地e)和g)的结果，测定所述多个细胞中是否存在除所述第一氨基酸序列以外的序列，从而分析多个细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.03 US 62/454,567;2017.02.28 US 62/464,775;1.分析多个细胞的方法，所述方法包括：a)培养多个细胞以制备包含产物的条件化培养基，所述多个细胞中的至少一个细胞包含编码产物的核酸序列，所述产物包含第一氨基酸序列；b)将来自所述包含产物的条件化培养基的第一多肽样品进行基于序列的第一反应以提供第一反应产物；c)将所述第一反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析；d)将来自包含产物的条件化培养基的第二多肽样品进行基于序列的第二反应以提供第二反应产物；e)将所述第二反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析；f)任选地，将来自包含产物的条件化培养基的第三多肽样品进行基于序列的第三反应以提供第三反应产物；g)任选地，将所述第三反应产物的数值与参考值进行比较，并且响应于所述比较，选择反应产物组分以进行进一步分析，h)响应于c)和任选地e)和g)的结果，测定所述多个细胞中是否存在除所述第一氨基酸序列以外的序列，从而分析多个细胞。2.权利要求1的方法，其包括进一步培养所述多个细胞以制备包含产物的第二条件化培养基；并对所述第二条件化培养基进行步骤b-h；任选地进一步包括培养所述多个细胞以制备包含产物的第三条件化培养基；并对所述第三条件化培养基进行步骤b-h；任选地进一步包括培养所述多个细胞以制备随后的包含产物的条件化培养基，例如第N个包含产物的条件化培养基，其中N＝4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；并且对随后的条件化培养基，例如第N个条件化培养基进行步骤b-h。3.权利要求1或2的方法，其中所述样品是等分试样。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中：(i)在所述产物产生的不同阶段产生所述多个条件化培养基，所述条件化培养基或第二、第三或随后的条件化培养基，例如第N个条件化培养基；或(ii)在培养所述多个细胞的不同时间点产生所述多个条件化培养基，所述条件化培养基或第二、第三或随后的条件化培养基，例如第N个条件化培养基。5.权利要求1-4中任一项的方法，其包括比较i)与ii)：i)在h)中对条件化培养基，所述条件化培养基或第二、第三或随后的条件化培养基，例如第N个条件化培养基之一进行的测定，ii)在h)中对条件化培养基，所述条件化培养基或第二、第三或随后的条件化培养基，例如第N个条件化培养基中的另一个进行的测定。6.权利要求1的方法，其进一步包括分析第二多个细胞，包括对所述第二多个细胞进行步骤a-h；任选地进一步包括分析第三多个细胞，包括对所述第三多个细胞进行步骤a-h；任选地进一步包括分析随后的多个细胞，例如第N多个细胞，其中N＝4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，包括对随后的多个细胞，例如第N多个细胞进行步骤a-h。7.权利要求6的方法，其包括比较i)与ii)：i)在h)中对所述多个细胞，所述第二、第三或随后的多个细胞，例如第N多个细胞之一进行的测定，ii)在h)中对所述多个细胞，所述第二、第三或随后的多个细胞，例如第N多个细胞中的另一个进行的测定。8.权利要求6或7的方法，其中每种多个细胞包含相同类型的细胞，或者其中所述多个细胞中的一种或多种，例如每种包含不同类型的细胞。9.权利要求7或8的方法，其包括响应于所述比较，选择多个细胞以产生包含所述第一氨基酸序列的产物。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述第一氨基酸序列对应于选自表1-4的蛋白质产物。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中b)、d)和任选地f)包括使多肽样品变性。12.权利要求11的方法，其中：(i)使纯化的蛋白质变性包括在存在盐酸胍(GuHCl)的情况下和于酸性pH温育所述纯化的蛋白质；或(ii)其中使所述纯化的蛋白质变性包括在存在尿素和脱氧胆酸盐的情况下温育所述纯化的蛋白质，任选地其中脱氧胆酸盐在消化所述纯化的蛋白质产物之前从溶液中沉淀出来，任选地其中(1)所述脱氧胆酸盐在b)之前、d)之前、和/或任选地在f)之前从溶液中沉淀出来，或(2)在任选地将所述反应产物进行分离步骤之前将所述脱氧胆酸盐从溶液中沉淀出来。13.权利要求12的方法，其中通过添加酸沉淀所述脱氧胆酸盐。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中b)、d)和/或任选地f)包括用TCEP还原所述纯化的蛋白质。15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述基于序列的反应是用蛋白水解酶消化。16.权利要求15的方法，其中所述蛋白水解酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、LysC和AspN。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中在适于高通量样品处理的装置中进行一个或多个步骤；任选地，其中在96孔板中进行一个或多个步骤。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中b)、d)和/或任选地f)任选地包含分离步骤，其包括使用LC/MS分析所述反应产物。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中c)、e)和/或任选地g)包括鉴定通过比较鉴定的所述反应产物的组分的氨基酸序列；任选地，其中鉴定所述氨基酸序列包括对所述反应产物的组分使用MS/MS。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述方法是自动化的。21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述方法采用机器人设备。22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述方法采用微流体系统。23.权利要求1-22中任一项的方法，其进一步包括在b)、d)和/或任选地f)之前，从所述含有产物的条件化培养基中纯化所述产物；任选地，其中纯化所述产物包括使用层析。24.权利要求1-23中任一项的方法，其包括清洗方案以从设备中除去残留污染。25.权利要求24的方法，其中所述清洗方案包括使用LC/MS分析空白样品。26.权利要求24的方法，其中所述清洗方案包括酸性溶液和高有机溶液的交替清洗。27.权利要求24或26的方法，其中所述清洗方案可以与分析多个细胞的方法、使用所述多个细胞的方法或由所述多个细胞制备的多肽的方法平行运行。28.权利要求27的方法，其中：(i)所述清洗方案不增加分析多个细胞的方法、使用所述多个细胞的方法或由多个细胞制备的多肽的方法的经过时间；(ii)与分析多个细胞的方法、使用所述多个细胞的方法或由多个细胞制备的多肽的方法平行运行所述清洗方案将所述方法的经过时间减少至少约50％、40％、30％、20％或10％；或(iii)与分析多个细胞的方法、使用所述多个细胞的方法或由多个细胞制备的多肽的方法平行运行所述清洗方案将清...

【专利技术属性】
技术研发人员：J格雷厄姆，
申请(专利权)人：隆扎有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH