可调控启动子制造技术

一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤：a)用阻遏所述启动子的基础碳源培养所述细胞系，b)用使所述启动子去阻遏的有限量的补充碳源培养所述细胞系，从而诱导POI以相比于天然pGAP启动子至少15％的转录速率产生，和c)产生并回收所述POI；以及另外地，分离的可调控的启动子和相应的表达系统。

Regulatory promoter

【技术实现步骤摘要】
可调控启动子本申请是申请日为2012年10月05日的、专利技术名称“可调控启动子”、PCT申请号：PCT/EP2012/069757、专利申请号：201280060753.0的中国专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及可调控启动子和在真核细胞培养中在可调控启动子的控制下产生感兴趣蛋白质的方法。
技术介绍
已使用真核宿主实现重组蛋白质的成功产生。最突出的例子是酵母如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、丝状真菌如泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或里氏木霉(Trichodermareesei)、或哺乳动物细胞如例如CHO细胞。尽管容易以高比率实现一些蛋白质的产生，但还有许多其他蛋白质仅在相当低的水平获得。基因在宿主生物体中的异源表达通常需要允许稳定转化宿主生物体的载体。载体会提供基因和临近编码序列5’端的功能性启动子。由此，转录由该启动子序列调控和启动。迄今使用的大多数启动子源自编码通常以高浓度存在于细胞中的蛋白质的基因。EP0103409A2披露了使用与糖酵解途径中特定酶的表达有关的酵母启动子，即牵涉丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘油酸变位酶、己糖激酶1和2、葡糖激酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶和糖酵解调控基因的表达的启动子。WO97/44470描述了来自解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)的用于翻译延长因子1(TEF1)蛋白和用于核糖体蛋白S7的酵母启动子，其适于在酵母中异源表达蛋白质，而EP1951877A1描述了将巴斯德毕赤酵母TEF1启动子用于产生异源蛋白质。WO2005003310提供用于在酵母中表达感兴趣编码序列的方法，其使用来自产油酵母解脂西洋蓍霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶或磷酸甘油酸变位酶的启动子。源自牵涉巴斯德毕赤酵母的甲醇代谢途径的基因的启动子序列披露在US4808537和US4855231(醇氧化酶AOX1、AOX2)和US6730499B1(甲醛脱氢酶FLD1)中。US20080153126A1包括基于AOX1启动子的突变体启动子序列。AOX1启动子仅应答甲醇而受到诱导并受其他碳源如葡萄糖或乙醇阻遏。甲醇的缺点在于其不适用于产生某些产物，因为其因毒性和易燃性而有潜在危险。因此，寻求AOX1启动子的备选物。US2008299616A1引入苹果酸合酶(MLS1)基因的调控序列用于在巴斯德毕赤酵母中的异源基因表达，其在含有葡萄糖的培养基中受到阻遏，而在葡萄糖饥饿条件下或在存在乙酸盐时去阻遏。然而，不将该系统视为适用于有效的产生方法，因为MLS1启动子在去阻遏条件下较弱且活性较低。和Schüller(Mol.CellBiol.199414(6):3613-22)描述了异柠檬酸裂合酶基因ICL1的调控区，其在将细胞从发酵生长条件转移至非发酵生长条件后去阻遏。WO2008063302A2描述了将源自巴斯德毕赤酵母的ADH1(醇脱氢酶)、ENO1(烯醇化酶)和GUT1基因的新的可诱导启动子用于异源蛋白质的表达，CN1966688A中为巴斯德毕赤酵母omega3-脂肪酸脱氢酶启动子序列，而WO002007117062A1中为巴斯德毕赤酵母来源的自动诱导(auto-inducible)的NPS启动子，其通过磷限制诱导。WO2008128701A2描述了新的启动子的使用，其中源自巴斯德毕赤酵母的THI3(硫胺代谢)基因的启动子在含有硫胺的培养基中受到阻遏，并在硫胺耗尽时去阻遏。US2009325241A1描述了一种采用木糖可诱导的启动子(FAS2启动子)在酵母细胞中产生乙醇的方法。期望提供改进的重组真核细胞系来产生能以高产率分离的发酵产物。因此，本专利技术的目标是提供适用于重组生产方法的备选的调控元件，其为简单且有效的。
技术实现思路
所述目标由所要求保护的主题解决。依照本专利技术，提供一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤：a)用阻遏所述启动子的基础碳源培养所述细胞系，b)用使所述启动子去阻遏的无或有限量的补充碳源培养所述细胞系，从而以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少15％的转录速率诱导所述POI的产生，和c)产生并回收所述POI。所述培养步骤具体地包括在所述碳源的存在下，由此在包含所述碳源的培养基中，或在步骤b)中还在不存在补充碳源的情况下培养所述细胞系。对所述POI产生的诱导具体指对转录的诱导，具体包括所述POI的进一步的翻译和任选地表达。所述转录速率具体指在完全诱导所述启动子时获得的转录本的量。如果培养条件提供大概最大的诱导，例如以低于0.4g/L，优选低于0.04g/L，特定地低于0.02g/L的葡萄糖浓度，那么所述启动子视为去阻遏且完全诱导的。优选地，完全诱导的启动子显示相比于天然pGAP启动子至少15％，优选至少20％，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和至少100％或甚至更高为至少150％或至少200％的转录速率。所述转录速率可以例如通过报告基因如eGFP的转录本的量测定，如记载于下文实施例部分的，其显示在溶液中培养克隆时pG1启动子相比于天然pGAP启动子至少50％的相对高的转录速率。或者，所述转录速率可通过在微阵列上的转录强度测定，其中微阵列数据显示受阻遏和去阻遏状态之间表达水平的差异和在完全诱导状态中相比于天然pGAP启动子的高信号强度。这类微阵列数据具体地对于pG1显示超过200％的转录速率，对于pG3和pG4超过30％，对于pG6超过60％，对于pG7超过30％，对于pG8超过20％的转录速率(每个值均与天然pGAP相比)。发现现有技术中的启动子太弱而不适用于本专利技术的目的。具体地，所述天然pGAP启动子在所述重组真核细胞中以类似于在同一物种或菌株的天然真核细胞中的方式而具有活性(包括未经修饰(非重组)或重组真核细胞)。这类天然pGAP启动子通常理解为内源启动子，如此，是真核细胞同源性的，且充当标准或参照启动子用于比较目的。例如，巴斯德毕赤酵母的天然pGAP启动子是巴斯德毕赤酵母中的未经修饰的内源性启动子序列，如用于控制中巴斯德毕赤酵母中GAPDH表达的，例如具有图13中显示的序列：巴斯德毕赤酵母(GS115)的天然pGAP启动子序列(SEQID13)。如果将巴斯德毕赤酵母用作产生依照本专利技术的POI的宿主，那么将依照本专利技术的启动子的转录强度或速率与巴斯德毕赤酵母的这类天然pGAP启动子相比较。再举一个例子，酿酒酵母的天然pGAP启动子是酿酒酵母中未经修饰的内源性启动子序列，如用于控制酿酒酵母中GAPDH表达的。如果将酿酒酵母用作用于产生依照本专利技术的POI的宿主，那么将依照本专利技术的启动子的转录强度或速率与酿酒酵母的这类天然pGAP启动子相比较。因此，通常将依照本专利技术的启动子的相对转录强度或速率与用作产生POI的宿主的同一物种或菌株的细胞的天然pGAP启动子相比较。依照一个具体的实施方案，所述基础碳源不同于补充碳源，例如定量和/或定性上不同的。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产生启动子变体的方法，所述启动子变体是选自下组的启动子的变体：由SEQ ID 1的核苷酸序列组成的pG1、由SEQ ID 2的核苷酸序列组成的pG3、由SEQ ID 4的核苷酸序列组成的pG4、由SEQ ID 3的核苷酸序列组成的pG6、由SEQ ID 5的核苷酸序列组成的pG7、和由SEQ ID 6的核苷酸序列组成的pG8，所述方法包括：a)诱变相应的启动子核苷酸序列，从而产生包含至少200bp的核苷酸序列并且与相应的启动子核苷酸序列具有至少80％序列同一性的变体，b)测定所述变体的转录速率，并且c)从所述变体选择启动子变体，所述启动子变体能够以与pGAP启动子(SEQ ID NO:13)相比以至少20％的转录速率，通过在所述启动子变体的转录控制下表达编码感兴趣蛋白质的核苷酸序列来在重组真核细胞中产生所述感兴趣蛋白质(POI)。

【技术特征摘要】
2011.10.07 EP 11184323.1;2012.06.06 EP 12171006.5;1.产生启动子变体的方法，所述启动子变体是选自下组的启动子的变体：由SEQID1的核苷酸序列组成的pG1、由SEQID2的核苷酸序列组成的pG3、由SEQID4的核苷酸序列组成的pG4、由SEQID3的核苷酸序列组成的pG6、由SEQID5的核苷酸序列组成的pG7、和由SEQID6的核苷酸序列组成的pG8，所述方法包括：a)诱变相应的启动子核苷酸序列，从而产生包含至少200bp的核苷酸序列并且与相应的启动子核苷酸序列具有至少80％序列同一性的变体，b)测定所述变体的转录速率，并且c)从所述变体选择启动子变体，所述启动子变体能够以与pGAP启动子(SEQIDNO:13)相比以至少20％的转录速率，通过在所述启动子变体的转录控制下表达编码感兴趣蛋白质的核苷酸序列来在重组真核细胞中产生所述感兴趣蛋白质(POI)。2.权利要求1的方法，其中在步骤b)中，在阻遏和去阻遏时测定所述变体的转录速率以选择碳源可调控的启动子变体。3.权利要求1的方法，其中选择启动子变体，其能通过碳源调控，使得i)当用阻遏所述启动子的基础碳源培养细胞时它在所述细胞中受阻遏，其中所述基础碳源是葡萄糖、甘油或其混合物；并且ii)当不用葡萄糖或用有限量的葡萄糖培养所述细胞时它在所述细胞中被去阻遏并且完全诱导。4.权利要求3的方法，其中选择启动子变体，其当在使用化学性质确定的且无甲醇的给料培养基培养所述细胞时被去阻遏并且完全诱导。5.权利要求4的方法，其中在采用不提供葡萄糖或提供有限量的葡萄糖的给料培养基的细胞培养物中测定所述转录速率。6.权利要求5的方法，其中所述葡萄糖的有限量是所述培养基中的0-1g/L。7.权利要求1的方法，其中在步骤a)中，所述诱变包括通过在序列内或者在序列远端之任一或两端处插入、缺失或取代一个或多个核苷酸来修饰相应的启动子核苷酸序列。8.权利要求1的方法，其中在步骤a)中，所述诱变包括产生pG1、pG3、pG4、pG7或pG8启动子中任一种的片段。9.权利要求8的方法，其中所述诱变包括产生选自下组的pG1启动子的片段：由SEQID41的核苷酸序列组成的pG1a、由SEQID42的核苷酸序列组成的pG1b、由SEQID43的核苷酸序列组成的pG1c、由SEQID44的核苷酸序列组成的pG1d、由SEQID45的核苷酸序列组成的pG1e和由SEQID46的核苷酸序列组成的pG1f。10.权利要求1的方法，其中在步骤a)中，所述诱变产生与相应的启动子核苷酸序列具有至少90％序列同一性的变体。11.权利要求1的方法，其中所述POI选自：治疗性蛋白质，包括抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质偶联物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、生长因子、激素和细胞因子。12.通过培养包含表达构建体的重组甲基营养型酵母产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达构建体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录控制下的编码感兴趣蛋白质的核酸分子，所述方法包括以下步骤：a)用阻遏所述启动子的基础碳源培养所述细胞系，其中所述基础碳源是葡萄糖、甘油或其混合物，b)在去阻遏并且完全诱导所述启动子的无葡萄糖或有限量的葡萄糖的情况下培养细胞系，并且c)产生并且回收所述感兴趣蛋白质，其中所述启动子包含选自以下的核酸序列：i)由SEQID1的核苷酸序列组成的pG1、由SEQID2的核苷酸序列组成的pG3、由SEQID4的核苷酸序列组成的pG4、由SEQID3的核苷酸序列组成的pG6、由SEQID5的核苷酸序列组成的pG7、或由SEQID6的核苷酸序列组成的pG8；ii)由SEQID41的核苷酸序列组成的pG1a、由SEQID42的核苷酸序列组成的pG1b、由SEQID43的核苷酸序列组成的pG1c、由SEQID44的核苷酸序列组成的pG1d、由SEQID45的核苷酸序列组成的pG1e和由SEQID46的核苷酸序列组成的pG1f；和iii)至少200bp并且与以下任一项具有至少80％序列同一性的序列：由SEQID1的核苷酸序列组成的pG1、由SEQID2的核苷酸序列组成的pG3、由SEQID4的核苷酸序列组成的pG4、由SEQID3的核苷酸序列组成的pG6、由SEQID5的核苷酸序列组成的pG7、或由SEQID6的核苷酸序列组成的pG8；并且其中所述启动子是碳源可调控的启动子，其能够在完全诱导并且使用化学性质确定的且无甲醇的给料培养基时在重组真核细胞中以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少20％的转录速率表达感兴趣蛋白质。13.权利要求12的方法，其中所述启动子包含与下列任一项具有至少90％序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：D玛塔诺维克，B加瑟，M茂勒，R普里尔霍佛，J克雷恩，J温格，
申请(专利权)人：隆扎有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH