使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法及应用，包括以下步骤：（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，复苏活化培养至对数生长期；（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，得到重组人白细胞介素-12标准品浓度值ED50s；（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，得到待测重组人白细胞介素-12蛋白质浓度值ED50r；（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，得到待测重组人白细胞介素-12蛋白质体外活性Pr。

Method and application for detection of recombinant human interleukin -12 in vitro using cells with interleukin -12 receptor

The invention discloses a method for detection of recombinant human cell with interleukin -12 receptor of interleukin -12 activity in vitro and its application, which comprises the following steps: (1) taking a frozen with interleukin -12 receptor cells from liquid nitrogen tank, activated and cultured to logarithmic growth recovery period; (2) with interleukin -12 receptor recombinant human interleukin-2 with different concentrations of -12 standard induced cells to produce interferon gamma, recombinant human interleukin -12 standard concentration value of ED50s; (3) to be measured using different concentrations of recombinant human interleukin -12 induced protein with interleukin -12 receptor cells to produce interferon, the measured results of recombinant human interleukin -12 protein concentration ED50r; (4) according to the formula of Pr=Ps * ED50s/ED50r, the measured results of recombinant human interleukin -12 egg In vitro activity of white matter Pr.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组人白细胞介素-12活性的检测技术，具体涉及一种使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法。
技术介绍
具有白细胞介素-12受体的细胞，能够受到白细胞介素-12的诱导，诱发细胞内的信号传导。NK-92是一株白细胞介素-2依赖型自然杀伤细胞株。实验证明，NK92细胞在白细胞介素-12的诱导下，调节细胞表面受体的表达量，增强与肿瘤细胞表面配体的结合，抑制和杀死肿瘤细胞。或者是NK92细胞通过分泌免疫因子（例如：干扰素）和其他细胞因子直接抑制肿瘤细胞生长。白细胞介素-12（IL-12）是一种异源二聚体分子，是由单核/巨噬细胞及B淋巴细胞产生的一种细胞因子。重组人白细胞介素-12（rhIL-12）是通过基因工程技术，采用真核细胞表达的编码人的白细胞介素-12。实验证明，重组人白细胞介素-12能够通过刺激NK细胞和T细胞增殖活化从而介导主动和被动免疫保护反应，是连接天然免疫和获得性免疫的功能性桥梁，具有多种重要生物学功能和药理作用，可应用于抗肿瘤、抗感染、抗哮喘、抗结核等多个领域。近年的研究发现，小剂量的rhIL-12可以刺激骨髓造血、保护造血微环境从而全面恢复受损血像，起到辐射和肿瘤放化疗防护的作用，作为抗辐射药试剂，重组人IL-12具有巨大的药物开发价值和临床应用价值。目前的研究中，rhIL-12的体外活性检测通常采用人的外周血，测定计数血细胞集落的方法，或者测定人外周血在rhIL-12刺激下产生γ干扰素的方法。用人外周血测定rhIL-12的活性，一方面细胞来源不能得到保证，同时由于人的个体差异，不能保证每次采集的血细胞性能相同，导致实验的准确性、精确性和重复性差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术中由于人的个体差异，导致rhIL-12的体外活性检测结果的准确性、精确性和重复性差的问题，提供一种检测准确性和精确性高、重复性好的使用具有白细胞介素-12受体的稳定细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法。本专利技术所要解决的第二个技术问题是：提供使用具有白细胞介素-12受体的细胞在检测重组人白细胞介素-12体外活性中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，包括以下步骤：（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期。（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值记作为ED50s。（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值记作为ED50r。（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值。所述步骤（2）和步骤（3）同时操作，并使用同源的具有白细胞介素-12受体的细胞，使用相同的培养条件和相同的操作步骤。优选的，步骤（1）中，从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，置换掉冻存液，按照具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中的密度为2～3×105进行重悬后，静置活化培养，将对数生长期的具有白细胞介素-12受体的细胞使用培养基重悬细胞，将活化后的具有白细胞介素-12受体的细胞转移到检测孔板中。所述具有白细胞介素-12受体的细胞，具有表达人白细胞介素-12的受体β1和β2（IL-12Rβ1和β2）的能力，能够与人白细胞介素-12结合，并且诱导产生γ干扰素（INF-γ）。所述具有白细胞介素-12受体的细胞，可以是细胞天然就有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力，也可以是通过人工重组的细胞，具有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力。优选的，所述具有白细胞介素-12受体的细胞是NK92细胞，所述NK92细胞具有天然表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力。作为进一步的优选，所述NK92细胞购买自美国典型培养物收集库（ATCC），编号为CRL-2407。优选的，步骤（1）、（2）、（3）中，所述培养和共培养均是在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中培养至对数生长期。优选的，步骤（1）、（2）、（3）中，培养至对数生长期时所述具有白细胞介素-12受体的细胞在步骤（1）中的培养基中以及在步骤（2）、（3）中的共培养体系中的密度均为1～5×105个/ml。作为进一步的优选，所述步骤（1）中的培养是在温度37℃、二氧化碳体积浓度是5%的环境中培养12～72小时。作为一种改进，所述步骤（2）和步骤（3）中重组人白细胞介素-12蛋白标准品和待测重组人白细胞介素-12蛋白质在共培养体系中的浓度为0.032ng/ml～51.2ng/ml，所述诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素的时间为2～120小时。作为进一步的改进，所述步骤（2）和步骤（3）中重组人白细胞介素-12蛋白标准品和待测重组人白细胞介素-12蛋白质在共培养体系中的浓度分别为：0.032ng/ml、0.06ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.8ng/ml、1.6ng/ml、3.2ng/ml、6.4ng/ml、12.8ng/ml、25.6ng/ml和51.2ng/ml。作为另一种改进，步骤（1）、（2）、（3）中，所述培养基是在MEM培养基中添加β巯基乙醇、叶酸、rhIL-2、马血清和胎牛血清组成的。优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的培养基为MEM培养基中含有0.1mM的β巯基乙醇、0.02mM的叶酸、100U/ml的rhIL-2、12.本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用具有白细胞介素‑12受体的细胞检测重组人白细胞介素‑12体外活性的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素‑12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期；（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素‑12标准品与步骤（1）得到的具有白细胞介素‑12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素‑12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素‑12标准品的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素‑12标准品的浓度值，该浓度值记作为ED50s；（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素‑12蛋白质与步骤（1）得到的具有白细胞介素‑12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素‑12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素‑12蛋白质的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素‑12蛋白质的浓度值，该浓度值记作为ED50r；（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素‑12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素‑12标准品的活性值；所述步骤（2）和步骤（3）同时操作，并使用同源的具有白细胞介素‑12受体的细胞，使用相同的培养条件和相同的操作步骤。...

【技术特征摘要】
1.使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的
方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快
速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期；
（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品与步骤（1）得到的具有
白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受
体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞
介素-12标准品的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得
到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品
的浓度值，该浓度值记作为ED50s；
（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质与步骤（1）得到的
具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素
-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重
组人白细胞介素-12蛋白质的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标
准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞
介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值记作为ED50r；
（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素
-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性
值；
所述步骤（2）和步骤（3）同时操作，并使用同源的具有白细胞介素-12受
体的细胞，使用相同的培养条件和相同的操作步骤。
2.如权利要求1所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞
介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述具有白细胞介素-12受体的细
胞，具有表达人白细胞介素-12的受体β1和β2的能力，能够与人白细胞
介素-12结合，并且被诱导产生γ干扰素。
3.如权利要求2所述的使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞
介素-12体外活性的方法，其特征在于：所述具有白细胞介素-12受体的细
胞，可以是细胞天然就有表达人白细胞介素-12受体β1和β2的能力，也

\...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵毅，李友海，李健，章方良，蒋忻坡，黄冰，卢世香，裴秀芝，王媛媛，丁会芹，
申请(专利权)人：青岛康立泰药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37