本发明专利技术提供一种2‑酮基‑L‑古龙酸的制备方法，首先对山梨糖发酵醪液进行浓缩，使醪液中山梨糖浓度达到500‑550mg/mL，然后将其作为碳源流加于2‑酮基‑L‑古龙酸的发酵过程中。采用本发明专利技术方法一方面可以避免在山梨糖发酵中过高的山梨醇浓度对黑醋菌生长的抑制作用，发酵结束后通过浓缩工艺提高山梨糖浓度；另一方面通过提高流加糖的浓度可降低工艺难度，操作简单，后提取容易，提高了设备利用率。
【技术实现步骤摘要】
2-酮基-L-古龙酸的制备方法
本专利技术涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及2-酮基-L-古龙酸的制备方法。
技术介绍
目前国内生产古龙酸多采用二步发酵法，二步发酵法通常采用混合菌系进行发酵。在二步发酵过程中，为提高发酵产率，多采用流加工艺:流加山梨糖和碳酸钠。流加碳酸钠的目的主要是调控pH值，反应产物是可溶的古龙酸钠。山梨糖作为流加碳源，在转化率一定的情况下，山梨糖流加量的多少，将直接代表二步发酵时2-酮基-L-古龙酸的产酸率。行业内山梨糖的生产主要是利用黑醋菌发酵转化山梨醇而获得。黑醋菌的发酵能力较强，30小时左右可以将发酵醪液中(山梨醇浓度为250-300mg/mL)的山梨醇转化成山梨糖。在此发酵醪液中山梨糖浓度为240-300mg/mL。将发酵结束的醪液作为底料碳源或流加碳源接入二步发酵罐内，由混合菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸。采用流加碳源发酵生产工艺，是解除高浓糖反馈抑制的经典方法，在抗生素、氨基酸发酵中应用很广泛。抗生素与氨基酸发酵中流加的葡萄糖浓度一般在550mg/mL左右。高于550mg/mL的浓度，葡萄糖会结晶出来，堵塞流加管道。当流加糖浓度过低时，发酵醪液稀释过大，产物浓度过低。 我国古龙酸发酵生产的最大特点，是利用混菌发酵的方式来完成。大菌一般使用巨大芽孢杆菌，小菌一般使用氧化葡萄糖酸杆菌。对古龙酸发酵的研究表明，糖酸转化率主要与大、小菌的活力，培养基的成分有密切关系，基本上研究的方向主要集中于大、小菌的搭配，大、小菌菌形转化的时间和培养基成分上。而对于流加碳源的浓度对发酵产酸的影响几乎没有涉及。然而，当山梨糖对古龙酸的转化率一定，小菌的产酸速率一定时，流加糖的浓度从250mg/mL提高到500mg/mL时，流加体积将减少一半，发酵醪液的产酸将提高20~40%。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用浓缩山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，首先对山梨糖发酵醪液进行浓缩，使醪液中山梨糖浓度达到500-550mg/mL，然后将其作为碳源流加于2-酮基-L-古龙酸的发酵过程中。其中，所述山梨糖发酵醪液的制备方法为:向山梨糖的发酵培养基中接入黑醋菌，于37°C发酵培养28~38小时，山梨糖终浓度为240~330mg/mL。所述山梨糖的发酵培养基配方为:山梨醇250~350mg/mL、玉米衆1.5~2.5mg/mL、酵母膏0.3~0.4mg/mL、碳酸钙0.6~0.8mg/mL,以水配制，pH值自然。优选地，所述山梨糖的发酵培养基配方为:山梨醇260mg/mL、玉米浆2mg/mL、酵母膏0.3mg/mL、碳酸钙0.7mg/mL,以水配制，pH值自然。 浓缩采用多效浓缩工艺,可选择双效浓缩、三效浓缩、四效浓缩,优选双效浓缩、三效浓缩；更优选双效浓缩。双效浓缩工艺具体为:先将山梨糖发酵醪液于75-80°C，真空度0.04-0.05MPa条件下浓缩15-25分钟；然后于55_60°C，真空度0.08-0.095MPa条件下继续浓缩15-25分钟。优选地，双效浓缩工艺具体为:先将山梨糖发酵醪液于78°C，真空度0.045MPa条件下浓缩20分钟；然后于58°C，真空度0.09MPa条件下继续浓缩20分钟。前述方法还包括在浓缩前对山梨糖发酵醪液进行膜过滤的步骤，使用的微滤膜孔径大小为0.01-0.2 μ m。微滤膜的主要作用是去除山梨糖发酵结束后醪液中黑醋菌的菌体，以防止在二效浓缩过程中出现美拉德反应，导致料液色泽加深，给古龙酸提取工艺带来不利影响。优选的，微滤膜孔径大小选择0.05 μ m.。前述方法中，向2-酮基-L-古龙酸的发酵培养基中按30v/v%的接种量接入巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌，并流加山梨糖发酵醪液，流加过程控制糖含量为20-22mg/mL ;起始温度为29°C，30小时后，温度升至30°C，36小时后，温度升至31°C，培养40~50小时，发酵培养过程中，控制发酵体系pH值为6.7-6.8。所述2-酮基-L-古龙酸的发酵培养基的配方为:山梨糖25mg/mL、酵母膏lmg/mL、玉米衆8mg/mL、尿素2mg/mL、硫酸镁0.6mg/mL、碳酸韩6mg/mL,以水配制。前述方法中，通过向发酵体系中加入碳酸钠来控制发酵体系的pH值。本专利技术首次 提出在古龙酸生产过程中利用浓缩山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺。在山梨糖发酵结束后采用浓缩工艺，使发酵醪液中山梨糖浓度达到500-550mg/mL，一方面可以避免在山梨糖发酵中过高的山梨醇浓度对黑醋菌生长的抑制作用，发酵结束后通过浓缩工艺提高山梨糖浓度；另一方面通过提高流加糖的浓度可降低工艺难度，操作简单，后提取容易，提高了设备利用率。可将本方法在应用于2-酮基-L-古龙酸的大规模生产。发酵终点产酸浓度提高20-30%，达到130-14011^/1^，糖酸转化率高达90-92%。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1利用浓缩山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺50L发酵罐中初始装液量为15L，发酵培养基配方为:山梨糖25mg/mL、酵母膏Img/mL、玉米衆8mg/mL、尿素2mg/mL、硫酸镁0.6mg/mL、碳酸钙6mg/mL,以水配制。按30v/v%的接种量接入巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合种子液，当残糖降至20mg/mL时，开始流加经浓缩后的山梨糖发酵醪液，醪液中山梨糖的浓度为500mg/L，流加过程控制糖含量为20-22mg/mL ;同时，发酵过程中流加碳酸钠，控制pH在6.7-6.8。发酵过程中，起始温度为29°C，30小时后，温度升至30°C，36小时后，温度升至31°C。发酵周期为44小时，发酵终体积为30L。经检测，发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量为115.lmg/mL，摩尔转化率为90.5%。其中，所述山梨糖发酵醪液的制备方法为:向山梨糖的发酵培养基中接入黑醋菌，于37°C发酵培养28小时，山梨糖终浓度为240mg/mL。然后，对山梨糖发酵醪液进行膜过滤，微滤膜孔径大小为0.05 μ m，滤液采用双效浓缩工艺，具体为:先将山梨糖发酵醪液于78°C，真空度0.045MPa条件下浓缩20分钟；然后于58°C，真空度0.09MPa条件下继续浓缩20分钟。所述山梨糖的发酵培养基配方为:山梨醇260mg/mL、玉米浆2mg/mL、酵母膏0.3mg/mL、碳酸钙0.7mg/mL,以水配制,pH值自然。实施例2利用浓缩山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺50L发酵罐中初始装液量为15L，发酵培养基配方同实施例1，按30V/V%的接种量接入巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合种子液，当残糖降至20mg/mL时，开始流加经浓缩后的山梨糖发酵醪液，醪液中山梨糖的浓度为526mg/L，流加过程控制糖含量为20-22mg/mL ;同时，发酵过程中流加碳酸钠，控制pH在6.7-6.8。发酵过程中，起始温度为29°C, 30小时后，温度升至30°C，36小时后，温度升至31°C。发酵周期为46小时，发酵终体积为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.2-酮基-L-古龙酸的制备方法，其特征在于，首先对山梨糖发酵醪液进行浓缩，使醪液中山梨糖浓度达到500-550mg/mL，然后将其作为碳源流加于2-酮基-L-古龙酸的发酵过程中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山梨糖发酵醪液的制备方法为:向山梨糖的发酵培养基中接入黑醋菌，于37°C发酵培养28~38小时，山梨糖终浓度为240~330mg/mL ； 其中，山梨糖的发酵培养基配方为:山梨醇250~350mg/mL、玉米衆1.5~2.5mg/mL、酵母膏0.3~0.4mg/mL、碳酸钙0.6~0.8mg/mL,以水配制，pH值自然。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，浓缩采用双效浓缩工艺，具体为:先将山梨糖发酵醪液于75-80°C，真空度0.04-0.05MPa条件下浓缩15-25分钟；然后于55_60°C，真空度0.08-0.095MPa条件下继续浓缩15-25分钟。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，双效浓缩工艺具体为:先将山梨糖发酵醪液于78 °C，真空度0.045MPa条件下浓缩20分钟；然后...
【专利技术属性】
技术研发人员：李荣杰，杨为华，邓远德，徐斌，穆晓玲，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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