一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法技术

本发明专利技术涉及一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其包括以下步骤：1)将BHK21细胞进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，接种至反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养，得到悬浮培养细胞液；2)将悬浮培养细胞液中的低血清培养基换成无血清培养基，继续培养，接毒进行病毒培养；3)继续培养BHK21悬浮细胞96～144h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融，离心，收集上清，即得病毒液；4)将病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。本发明专利技术所得的猪伪狂犬病毒抗原疫苗效价高，稳定在10

Method for producing pseudorabies virus antigen by whole suspension cell culture

The invention relates to a method for producing porcine pseudorabies virus antigen in a cell suspension culture, which comprises the following steps: 1) BHK21 cells were recovered, amplified by shake flask suspension culture were inoculated into the reactor with low serum medium for suspension culture, cell suspension culture by liquid; 2) the cell suspension culture liquid in low serum medium in serum-free medium, and cultured for virus inoculation culture; 3) to culture BHK21 cell suspension of 96 ~ 144H, until the number of dead cells reached more than 90%, harvest cell suspension, freeze thawing, centrifugation, the supernatant was collected to obtain the virus liquid; 4) virus liquid concentration, inactivation, sterilization, i.e.. The pseudorabies virus antigen vaccine obtained by the invention has high titer and is stable at 10

【技术实现步骤摘要】
一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法。
技术介绍
体外细胞培养生产病毒是国内外最常用的手段，其中，传统的转瓶细胞培养工艺存在细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等缺点，逐渐为新兴的细胞悬浮培养技术所取代。细胞悬浮培养技术以其自动化、规模化、细胞培养简易化、操作安全化、批间均一化等优势弥补了传统转瓶培养技术的众多不足，解决实际生产过程中的人工、成本、场地、生产周期、原材料控制、质量不稳定等诸多问题。悬浮培养技术是在生物反应器中、人工条件下高密度大规模培养动物细胞用于生物制品生产的技术，根据细胞是否贴壁，分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养。细胞微载体悬浮培养即细胞贴附在微载体上，再借助搅拌系统悬浮在培养液中培养。载体培养本质上还是贴壁培养，技术难度低，适用于难以驯化为全悬浮的细胞，而且载体培养在成本、细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷，其最大培养体积不超过300升，这限制了该技术的大规模化应用。全悬浮细胞培养不需要借助微载体，可在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会，实现线性化放大生产，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量，因此，利用全悬浮细胞培养技术生产病毒疫苗具有重大的应用前景。如公开号为：CN104027798A的中国专利申请“一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法”以PK-15B1细胞全悬浮无血清培养生产PCV2抗原，可获得高产量和质量的猪圆环病毒2型抗原。猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)属于疱疹病毒科中疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型，能引起急性传染的猪伪狂犬病(Aujeszky′sdisease)。猪伪狂犬病在世界范围内大流行，对全球的养猪业危害极大，造成巨大的经济损失。猪发生伪狂犬病以后，其临床症状取决于感染猪的年龄、病毒株的毒力、感染的剂量和途径。成年猪一般呈隐性感染，怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊和种猪不育等综合症候群。15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率40％，死亡率20％左右；对成年肥猪可引起生长停滞，增重缓慢等。目前本病被认为是威胁养猪生产和引起死亡的主要疾病之一。目前，国内体外细胞生产猪伪狂犬病毒抗原主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法。其中，转瓶工艺生产半成品抗原效价较低，仅为105.0-6.8TCID50/mL，需要进行高倍浓缩，且生产周期长，需要10天。而微载体悬浮培养工艺，较转瓶工艺虽有提高，仍存在较大改进空间，其生产周期仍需6～7天，且成本较高，难以实现扩大培养。目前，没有利用全悬浮细胞培养技术生产猪伪狂犬病毒抗原的相关报道。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法。本专利技术提供的技术方案为如下：本专利技术提供一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其包括以下步骤：(1)将种子细胞BHK21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，然后接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养，得到悬浮培养细胞液；(2)将生物反应器中悬浮细胞停止搅拌并低温沉降18～24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养1～2d，然后将PRV种毒液接种入反应器中，进行病毒培养；(3)在生物反应器中继续培养BHK21悬浮细胞96～144h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融3次，4000rpm离心5min，收集上清，即得病毒液；(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。进一步地，上述步骤(1)将种子细胞BHK21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×105个/mL的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含2～4％新生牛血清的营养液进行悬浮培养，直至细胞密度达到2～4×106个/mL。进一步地，所述摇瓶悬浮培养的条件为：将摇瓶置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，转速设置为130～150rpm/min；进一步地，所述含2～4％新生牛血清的营养液为含有0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、20～40g/LNBCS、6～12mg/L软磷脂、4～6％(m/v)生长促进剂的DMEM/F12(1:1)培养液。进一步地，所述步骤(1)接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养具体为：待摇瓶中的细胞长至2～4×106个/mL，停止摇瓶，2000rpm离心5min，弃掉上清，加入低血清培养基调整细胞密度至3～5×105个/mL，然后接种于搅拌式生物反应器中，在低血清培养基条件下，于在37℃，5％CO2，pH7.0～7.4，溶氧DO30～60％，搅拌速度100～120r/min继续进行悬浮培养。进一步地，所述低血清培养基为含有0.2～0.6％(m/v)植物蛋白肽、0.5～1.0％(m/v)FBS、0.1～0.5％(m/v)大豆异黄酮、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(m/v)生长促进剂的DMEM/F12(1:1)培养液。优选地，所述低血清培养基还含有2～4％(m/v)聚谷氨酸。进一步地，所述步骤(2)具体为：待反应器中的细胞长至2～4×106个/mL，将反应器中悬浮细胞停止搅拌并在4～6℃下沉降18～24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养1～2d，然后按细胞悬液体积1％的比例接种PRV种毒液，进行病毒培养，所述种毒液中病毒含量为105.2TCID50/mL。进一步地，所述无血清培养基为含有0.6～1.2％(m/v)植物蛋白肽、0.2～0.6％(m/v)大豆异黄酮、1.5～3.5％(m/v)聚谷氨酸、1.0～1.2％(v/v)双抗、4～6％(m/v)生长促进剂的DMEM/F12(1:1)培养液。本专利技术所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成，优选地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。进一步地，所述步骤(4)浓缩具体为：将病毒液通过50K中空纤维柱进行浓缩；灭活具体为：采用福尔马林灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％；除菌具体为：将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。进一步地，上述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。进一步地，上述采取全悬浮细胞培养制得的猪伪狂犬病毒抗原可添加一定量的佐剂乳化制成成品疫苗。本专利技术人在试验中发现，将使用含10％新生牛血清的DMEM培养基培养的BHK21细胞扩增到细胞密度达到2～4×106个/mL，直接加入低血清培养基进行悬浮培养，BHK21细胞的生长速度缓慢，细胞活性下降，低血清培养基不能支撑悬浮BHK21细胞持续稳定的生长。本专利技术人通过大量的试验意外发现，在使用含10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将种子细胞BHK21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，然后接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养，得到悬浮培养细胞液；(2)将生物反应器中悬浮细胞停止搅拌并低温沉降18～24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养1～2d，然后将PRV种毒液接种入反应器中，进行病毒培养；(3)在生物反应器中继续培养BHK21悬浮细胞96～144h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融3次，4000rpm离心5min，收集上清，即得病毒液；(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。

【技术特征摘要】
1.一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将种子细胞BHK21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，然后接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养，得到悬浮培养细胞液；(2)将生物反应器中悬浮细胞停止搅拌并低温沉降18～24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养1～2d，然后将PRV种毒液接种入反应器中，进行病毒培养；(3)在生物反应器中继续培养BHK21悬浮细胞96～144h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融3次，4000rpm离心5min，收集上清，即得病毒液；(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。2.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于，所述步骤(1)将种子细胞BHK21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×105个/mL的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含2～4％新生牛血清的营养液进行悬浮培养，直至细胞密度达到2～4×106个/mL。3.根据权利要求2所述的全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于，所述摇瓶悬浮培养的条件为：将摇瓶置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，转速设置为130～150rpm/min；所述含2～4％新生牛血清的营养液为含有0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、20～40g/LNBCS、6～12mg/L软磷脂、4～6％(m/v)生长促进剂的DMEM/F12(1:1)培养液。4.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其特征在于，所述步骤(1)接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养具体为：待摇瓶中的细胞长至2～4×106个/mL，停止摇瓶，2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，严悌昆，敖艳华，黄淑芬，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44