一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。本发明专利技术采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用赖氨酸、重组人胰岛素、人血清白蛋白、鱼精蛋白、生物素、藻酸双酯钠和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明专利技术采用LMH传代细胞系进行鸭呼肠孤病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。同时，本发明专利技术制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
鸭呼肠孤病毒是我国近年来新出现的，以肝脏不规则坏死，出血斑和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，该病是由一种新的RNA病毒引起，其病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒。其发病率和死亡率差异较大，但患病鸭日龄愈小，发病率和死亡率越高。据程安春等的报道，感染3～50日龄的鸭，感染鸭品种包括北京鸭、櫻桃谷鸭、天府肉鸭、四川麻鸭等；潜伏期为4～6天；病初精神萎靡，不愿活动，随着病情发展卧地不起，喜饮水，腹泻，呼吸困难，眼睑充血、出血并严重肿胀，病鸭头部明显肿胀；剖检见消化道、呼吸道、肝、脾、心脏、肺、肾、肠和卵巢等出血，头部下有淡黄色透明渗出液(程安春等，2003)。张宝来于2008年从湖北省某肉鸭场病鸭中亦分离鉴定出一株鸭源禽呼肠孤病毒，患病率和死亡率均较高；临床症状可见腹泻，流泪，生长缓慢；剖检见脾脏表面散布灰白色坏死点；病理组织学检查表明，脾脏内坏死灶较多，且结缔组织包围坏死灶，出现大量吞嚼含铁血黄素的巨暖细胞。肝细胞胞核消失溶解。透射电镜观察显示，脾脏内亦有大量的巨唆细胞和嗜酸性粒细胞(张宝来，2009)。2010年李爽利用从临床分离出的鸭源呼肠孤病毒感染日龄楼桃谷鸭，感染后精神抑郁，下痢，流泪，釆食量减少，感染7天后，发病率高达100％，病死率占5.56％。剖检病变是肝脾肿大，且有大小不等的坏死灶，此外，胸腺、心肌和法氏囊等出血、肿胀(李爽，2010)。由于本病毒目前没有相关的药物控制以及有效的疫苗进行预防保护，为此，生产相关有效疫苗尤为必要。专利文献CN108913666A公开了一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用，本专利技术公开了一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒及其灭活疫苗和应用，该鸭呼肠孤病毒已于2018年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNO：V201843，以该鸭呼肠孤病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，能够对新分离的变异株提供完全保护。专利文献CN109718370A公开了一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法，该方法是在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗，利用Reed-Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到107.0-107.5TCID50/0.1mL。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素，用BHK-21细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。制备得到的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。然后，目前虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，因此研究和开发出抑制效果更好的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗仍是目前亟需解决的难题。
技术实现思路
为了解决现有技术中的缺陷，本专利技术提供一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法。本专利技术是采用动物传代细胞LMH细胞进行病毒增殖，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，免疫原性好的优点。本专利技术提供了一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:1000～1:5000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取95～98份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000～18000rpm的条件下乳化4～6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。进一步地，所述步骤S1中LMH细胞可以替换为BHK-21细胞、DF-1细胞或Duckembroy细胞，其效果与LMH细胞的效果基本一致。进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：赖氨酸2～4mmol/L、重组人胰岛素4～10μg/mL、人血清白蛋白1～3mg/mL、鱼精蛋白4～8μg/mL、生物素2～4μg/mL、藻酸双酯钠1～3mg/L和生长因子10～15mmol/L。进一步地，所述步骤S2中的培养基A包括DMEM/F12基础培养基，还包括如下组分及其浓度：赖氨酸3mmol/L、重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、鱼精蛋白6μg/mL、生物素3μg/mL、藻酸双酯钠2mg/L和生长因子12mmol/L。进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比(2～4):(1～3)组成。进一步地，所述生长因子由焦磷酸硫胺素和丹参素钠按质量比3:2组成。进一步地，所述步骤S1中的LMH细胞放置转瓶内培养。进一步地，所述步骤S1中的LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量为2～10g/L。本专利技术人一直致力于研究生长因子对疫苗病毒含量和疫苗效价的影响，在之前的研究中发现采用由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定质量比组成的生长因子可以有效的提高禽流感病毒、禽腺病毒等灭活疫苗的病毒含量，提高疫苗的效果。本专利技术人将由焦磷酸硫胺素和天麻素按特定质量比组成的生长因子应用于鸭呼肠孤病毒的培养，发现其对鸭呼肠孤病毒的增殖效果不明显，对鸭呼肠孤病毒疫苗的效价影响不大。专利技术人经过大量的研究发现，丹参素钠可以促进鸭呼肠孤病毒含量的增长，但是效果不明显。将焦磷酸硫胺素与丹参素钠按质量比(4～6):(1～3)组成的生长因子对鸭呼肠孤病毒含量的增长效果与丹参素钠单一成分相比增加幅度不大，接着专利技术人又经过大量的摸索试验发现，将焦磷酸硫胺素的含量降低，与丹参素钠按质量比(2～4):(1～3)组成的生长因子可以有效的增加鸭呼肠孤病毒含量。另外，本专利技术提供的培养基中的添加的藻酸双酯钠可以进一步提高鸭呼肠孤病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量。其可能的原因是：藻酸双酯钠可以很好的分散和疏松鸭呼肠孤病毒细胞，从而可以使细胞充分的与培养基中的生长因子或其他营养物质接触，从而可以提高细胞繁殖和鸭呼肠孤病毒增殖的速度，而且藻酸双酯钠还本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:1000～1:5000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班‑80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班‑80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取95～98份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入3～5份吐温‑80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000～18000rpm的条件下乳化4～6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种鸭呼肠孤病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM/F12培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；S2病毒的接种：将鸭呼肠孤病毒液按终体积1:1000～1:5000接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，收集鸭呼肠孤病毒上清液，接着进行TCID50检测，合格后，将上述上清液超滤浓缩，得鸭呼肠孤病毒液；S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的鸭呼肠孤病毒液，得鸭呼肠孤病毒疫苗抗原；S5疫苗配制：a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司班-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司班-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；b水相制备：取95～98份步骤S4得到的鸭呼肠孤病毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000～18000rpm的条件下乳化4～6min，按照每瓶250mL进行分装，即得。2.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，严悌昆，谢秉超，黄淑芬，张桂平，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44