一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其是在传代细胞系BHK‑21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。利用Reed‑Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到10

A duck reovirus vaccine and its preparation method

The invention discloses a duck reovirus vaccine, which is an inactivated vaccine obtained by inoculating duck reovirus virus seed on the passaged cell line BHK 21. The virus titer can be determined by Reed Muench method to reach 10.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
我国自1997年起，在两广、浙、闽、豫和鄂等省爆发了以鸭肝脏上有白色坏死点为特征的病。本病在遇到混合感染或应激时死亡率非常高。通常，此病主要发生于7～45日龄番鸭，致病率高达20％～90％，死亡率为10～50％。感染鸭多表现为腹海，软脚，附关节或趾关节不同程度肿胀，耐过鸭变为僵鸭；剖检可见肝、脾、胰、肾和肠的坏死。此以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，俗称"鸭新肝病"、"鸭坏死性肝炎病"等，经分离鉴定其病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属鸭呼肠孤病毒。目前尚没有鸭呼肠孤病毒疫苗上市，也没有相关的药物控制该病毒导致的疾病，鸭呼肠孤病毒感染疾病的发生常给养鸭业造成重大经济损失。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是有效预防鸭呼肠孤病毒。为解决上述技术问题，本专利技术公开一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其是在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。所述鸭呼肠孤病毒疫苗的制备方法，其包括如下步骤：(1)BHK-21细胞的传代与培养：BHK-21细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；(2)病毒的接种和培养：取已形成单层的上述细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，将呼肠孤病毒毒种按终体积1:100～1:1000接种到制备的细胞，吸附后吸弃病毒液，在用培养液培养至细胞出现病变时收获；(3)病毒的收集、浓缩、纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液；(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原；(5)使用疫苗抗原配置疫苗制剂。优选所述步骤(1)中的细胞生长液为含5～10％新生牛血清的DMEM培养液,所述细胞生长液中可含双抗。所述步骤(2)所述细胞维持液为无血清的DMEM培养液，毒种接种到细胞后在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，接毒后在培养液中培养条件为37℃、5％CO2，所述培养液为含1～2％新生牛血清的DMEM培养液，细胞维持液中可含有2mM的谷氨酰胺，更优选含有0.2mM的N-N-二乙基-1-4-苯二胺。所述步骤(3)中所述制苗病毒液每0.1mL病毒大于含量107.0TCID50。所述步骤(1)中BHK-21细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。所述步骤(5)配置疫苗制剂包括如下步骤：a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-804份，先将白油缓慢加温，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；c)乳化：利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；d)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。本专利技术所公开鸭呼肠孤病毒疫苗采用病毒高适应性的传代细胞系BHK-21细胞进行疫苗生产,该工艺具备以下优势：1.细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，非常适用生物反应器进行大规模培养，这符合未来疫苗生产趋势，因此本专利技术具备高度的工艺前瞻性。2.使用BHK-21传代细胞系制备疫苗，半抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。用BHK-21传代细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖，利用Reed-Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到107.0-107.5TCID50/0.1mL。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素,用BHK-21细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。本专利公开的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。具体实施方式以下通过具体实施例再对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本专利技术上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本专利技术的范围内。以下实施例所使用的鸭呼肠孤病毒为自行分离鉴定：采用RT-PCR扩增，测序进行序列比，同时进行动物回归和鸭胚适应性试验进行进一步确定为鸭呼肠孤病毒。实施例1制备方法：(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入5％新生牛血清的DMEM培养液在转瓶内37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:100接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，在用含1％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。(3)病毒收集、浓缩和纯化及病毒含量测定：将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用于超滤浓缩。将上述离心后的上清液用30K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层BHK-21细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞；每孔0.2mL，5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL病毒含量107.0TCID50，可用于制苗。(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。实施例2制备方法：(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入10％新生牛血清的DMEM培养液在微载体反应器中37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:1000接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附60分钟后吸弃病毒液，在用2％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒含量测定：每0.1mL病毒含量107.5TCID50，可用于制苗。(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原。实施例3制备方法：(1)将BHK-21细胞，用胰酶消化分散，加入7％新生牛血清的DMEM培养液在微载体反应器中37℃、5％CO2培养至细胞单层后，弃去原培养液，再用含有2mM的谷氨酰胺的无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸭呼肠孤病毒接种。(2)病毒的接种和培养：将鸭呼肠孤病毒毒种按终体积1:500接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附45分钟后吸弃病毒液，在用1.5％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养至细胞，出现病变时终止。(3)病毒收集、浓缩和纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液。方法同实施例1并进行病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其特征在于：其是在传代细胞系BHK‑21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其特征在于：其是在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。2.如权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒疫苗的制备方法，特征在于，包括如下步骤：(1)BHK-21细胞的传代与培养：BHK-21细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；(2)病毒的接种和培养：取已形成单层的上述细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，将呼肠孤病毒毒种按终体积1:100～1:1000接种到制备的细胞，吸附后吸弃病毒液，在用培养液培养至细胞出现病变时收获；(3)病毒的收集、浓缩、纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液；(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原；(5)使用疫苗抗原配置疫苗制剂。3.如权利要求2所述的鸭呼肠孤病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述步骤(1)中的细胞生长液为含5～10％新生牛血清的DMEM培养液。4.如权利要求2所述的鸭呼肠孤病毒疫苗的制备方法，特征在于，所述步骤(2)所述细胞维持液为无血清的DMEM培养液，毒种接种到细胞后在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，接毒后在培养液中培养条件为37℃、5％CO2，所述培养液为含1～2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，严悌昆，谢秉超，黄淑芬，张桂平，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44