一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺制造技术

本发明专利技术属于微生物培养技术领域，具体涉及一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺。本发明专利技术将从海南感染无乳链球菌导致发病的罗非鱼肾脏组织分离鉴定得到无乳链球菌株，分别经过菌种活化和菌种培养，培养过程简单，发酵时间短，所采用的复合液体培养基可以为无乳链球菌的生长和增殖提供必要的营养原料：同时所添加的酵母提取物与促生长剂协同作用，可以有效提高无乳链球菌培养过程中的活菌数，同时能欧有效提高无乳链球菌的菌体浓度以及C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白等三种毒力蛋白的表达量，为进一步研制罗非鱼无乳链球菌疫苗奠定了基础。制罗非鱼无乳链球菌疫苗奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺


[0001]本专利技术属于微生物培养
，具体涉及一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺。

技术介绍

[0002]罗非鱼（Tilapia）为一种中小型鱼，它是世界水产业重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，罗非鱼是我国重要的出口型经济鱼类之一，其健康养殖的意义重大。
[0003]随着水产养殖集约化和规模化的迅猛发展，罗非鱼养殖密度不断加大，亩产可高达2万斤，随之带来的养殖病害、水体污染等问题不断加剧。当前，链球菌病是罗非鱼养殖所面临的严重重且难处理的病害之一，其传染性极强，死亡率高达 80%以上，严重影响罗非鱼产业发展。罗非鱼链球菌病的病原主要为无乳链球菌和海豚链球菌，其中以无乳链球菌为主。无乳链球菌是革兰氏阳性菌，表面光滑湿润并略显凸起，边缘比较整齐，呈圆形，乳白色，显微镜下可见一个或者多个球形或链状菌体。鱼体感染致病性链球菌后，表现功能异常、眼巩膜白浊和体表出血等特征，通常致死率较高。
[0004]对于罗非鱼链球菌病的防治，目前主要依赖于抗生素药物。但抗生素药物的长期使用所带来的菌株变异、药物残留和污染环境等严重问题已倍受社会关注。因此，从长远来看，开发有效的免疫防治技术，仍是控制罗非鱼链球菌病的主流方向，其中疫苗防治是一条国际推荐且被认可的既绿色又环保的重要途径之一。
[0005]疫苗的研制需要无乳链球菌的大规模培养，在无乳链球菌感染罗非鱼的过程中，荚膜多糖(GPS)、β
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溶血素/溶细胞素CAMP 因子、C5a肽酶、透明质酸酶、超氧化物歧化酶和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶等毒力因子扮演着重要的角色。无乳链球菌的多种表面蛋白、β蛋白质、5a 肽酶、Lmb、FbsA、Sip等）具有重要免疫原性，在致病过程中可能起着重要作用。通过不同血清型GBS的多基因组分析和筛查研究显示C5a肽酶（简称ScpB）、Sip蛋白、LrrG蛋白经现有技术中实验证实具有较好的免疫原性，并且理论上存在于所有的 GBS 菌株中，因此成为制备 GBS 疫苗的主要候选成分，而现有技术中，对罗非鱼无乳链球菌中培养，获得的这三种毒力蛋白的含量较低，而想要获得大量的C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白通常需要采用基因工程的方法，将所需的重组蛋白的编码基因构建到表达载体上，获得重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，使转化的宿主细胞表达产生所述无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白。虽然通过上述方法能够特异性的得到用于生产疫苗所需要的蛋白，但是现有技术中，基因工程的技术方案复杂，同时对实验操作及实验条件的要求十分苛刻，不利于大规模的工业化生产。
[0006]因此，有必要提供一种罗非鱼链球菌的培养方法，通过简单的培养工艺，有效提高罗非鱼无乳链球菌中的三种毒力蛋白C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白的高效表达，从而可以应用于制备控制罗非鱼无乳链球菌疾病的发生的高效疫苗。

技术实现思路

[0007]在为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺。本专利技术提供的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，能够有效提高无乳链球菌的菌体浓度以及C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白等三种毒力蛋白的表达量。
[0008]本专利技术的技术方案是:一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，具体包括如下步骤：S1、菌种活化：将罗非鱼无乳链球菌菌种划线于BHI固体培养基上，培养，得活化菌种；S2、菌种培养将步骤S1所得的活化菌种接种于复合液体培养基中，并培养8~16h，即得培养后的罗非鱼无乳链球菌。
[0009]进一步地，所述罗非鱼无乳链球菌菌株为HN01株，从海南感染无乳链球菌导致发病的罗非鱼肾脏组织分离鉴定，具体分离方法如下：将发病罗非鱼在无菌条件下取出肾脏组织，在生物安全柜中用接种环在酒精灯下消毒，冷却后蘸取肝脏组织，划线于BHI固体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养24小时后，挑取单菌落部分进行分子鉴定，然后划线于BHI固体培养基，经纯净性检验合格后，添加30%甘油于
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80℃保存备用。
[0010]进一步地，所述步骤S1菌种活化的过程为：将保存于
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80℃的罗非鱼无乳链球菌菌种划线于BHI固体培养基上，然后置于22~30℃的生化培养箱中恒温倒置培养23~25h。
[0011]进一步地，所述BHI固体培养基的制备方法如下：向1000ml BHI液体培养基中加入150g琼脂粉末，搅拌均匀，然后高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用。
[0012]进一步地，所述步骤S2中的接种量为1~4%。
[0013]进一步地，所述步骤S2中的培养条件为：将接种后的复合液体培养基置于22~30℃振荡培养箱，在100~150r/min的转速下培养8~16h。
[0014]进一步地，所述复合液体培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括如下组分：胎牛血清1~4vol%，酵母提取物2~8g/L，乳糖2~5 g/L，促生长剂4~16mg/L，L
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半胱氨酸3~8 mg/L，硫酸软骨素0.2~1.4mg/L。
[0015]更进一步地，所述添加剂包括由如下组分组成：包括胎牛血清2 vol%，酵母提取物5g/L，乳糖3g/L，促生长剂12mg/L，L
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半胱氨酸5mg/L，硫酸软骨素0.8mg/L。
[0016]进一步地，所述基础培养基为BHI液体培养基。
[0017]进一步地，所述促生长剂为异鼠李素、还原型谷胱甘肽和刺五加苷E按重量比1~5:2~7:3~13组成。
[0018]更进一步地，所述促生长剂为异鼠李素、还原型谷胱甘肽和刺五加苷E按重量比2:5:10组成。
[0019]本专利技术提供的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺中，在菌种培养过程中采用了复合液体培养基，其中添加的胎牛血清能够为菌种提供丰富的必须的营养成份；添加的乳糖为可发酵的糖类物质，能够在菌种的培养过程中提供碳源和能源；添加的酵母提取物中富含丰富的蛋白质、维生素、酵母多糖和微量元素等。
[0020]另外，本专利技术在研究过程中发现，通过向基础培养基中添加特定量的酵母提取物
和由异鼠李素、还原型谷胱甘肽和刺五加苷E按特定比例组成的促生长剂进行协同作用，有效的促进了无乳链球菌的繁殖，同时能够提高制备工程中无乳链球菌的菌种活力及数量，从而有效增强了无乳链球菌对C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白的表达量，有利于大规模获得这三种毒力蛋白，从而为下一步研制进罗非鱼无乳链球菌疫苗提供原料。
[0021]进一步地，所述复合液体培养基的制备方法如下：向基础培养基中加入胎牛血清，乳糖，L
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半胱氨酸和硫酸软骨素，在搅拌速度为80~120r/min的条件下，搅拌3~12min，然后加入酵母提取物和促生长剂，继续搅拌10~20min，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
[0022]与现有技术相比，本专利技术提供的罗非鱼无乳链球本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，其特征在于，包括如下步骤：S1、菌种活化：将罗非鱼无乳链球菌菌种划线于BHI固体培养基上，培养，得活化菌种；S2、菌种培养：将步骤S1所得的活化菌种接种于复合液体培养基中，并培养8~16h，即得培养后的罗非鱼无乳链球菌。2.如权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，其特征在于，所述步骤S1菌种活化的过程为：将保存于
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80℃的罗非鱼无乳链球菌菌种划线于BHI固体培养基上，然后置于22~30℃的生化培养箱中恒温倒置培养23~25h。3.如权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，其特征在于，所述步骤S2中的接种量为1~4%。4.如权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，其特征在于，所述步骤S2中的培养条件为：将接种后的复合液体培养基置于22~30℃振荡培养箱，在100~150r/min的转速下培养8~16h。5.如权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，其特征在于，所述复合液体培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括如下组分：胎牛血清1~4vol%，酵母提取物2~8g/L，乳糖2~5g/L，促生长剂4~16mg/L，L
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半胱氨酸3~8 mg/L，硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：严悌昆，张毓金，黄淑芬，董有勇，朱炜斌，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：