一种硝化细菌的常温保藏方法技术

本发明专利技术涉及一种硝化细菌的常温保藏方法，包括（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，收集菌体；（2）将菌体和微藻投加至保藏液中，进行保藏；保藏条件为室温、光暗交替培养，日光照总时间高于8h；（3）保藏结束后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，得到活性稳定的硝化菌。本发明专利技术采用藻菌共生方式实现菌体大批量常温保藏，具有常温保藏周期长、保藏活性好、恢复速度快等优点。恢复速度快等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种硝化细菌的常温保藏方法


[0001]本专利技术涉及硝化细菌的保藏，具体涉及一种硝化细菌的常温保藏方法。

技术介绍

[0002]氮素是造成水体污染的重要因素之一，目前多采用生物法去除。生物脱氮是通过硝化反应先将氨氮氧化为硝氮或/和亚硝氮，再通过反硝化反应将硝氮或亚硝氮还原成气态氮从水中除去，主要依靠硝化菌和反硝化菌实现。菌种是重要的生物资源之一，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期在生产中应用。
[0003]微生物菌种保藏的基本原理主要是根据微生物生理生化特点，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。菌种保藏方法很多，一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。为了有效地保藏微生物菌种，就需要针对菌种的特性和保藏需求开发适宜的保藏方法。
[0004]目前国内外常用的菌种保藏方法有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、超低温冰箱冷冻法、超低温液氮冷冻法等。其中冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐，且需要使用保护剂，保藏成本较高。
[0005]CN103103143A公开了一种硝化菌保藏方法，包括（1）将硝化菌体培养至生长稳定期，并收集硝化菌；（2）配制硝化菌保藏营养液；（3）步骤（1）收集的硝化菌与步骤（2）配制的硝化菌保藏营养液混合，含水率为40%～80%，含水率指菌体湿重和培养液体积比；（4）添加保藏剂；（5）冷冻保藏。该法具有方法简单和存活率高等优点，但需添加保藏剂且采用冷冻保藏，保藏成本相对较高。
[0006]CN106554921A公开了一种硝化细菌的保藏方法，包括（1）在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，所述生长促进剂包括金属盐和多胺类物质，其中金属盐为40
‑
100重量份，多胺类物质为5
‑
30重量份；所述金属盐由钙盐、铜盐、镁盐和/或亚铁盐组成；培养至进入生长稳定期后，收集菌体；（2）配制硝化细菌保藏营养液；（3）将步骤（1）收集的硝化细菌与步骤（2）配制的保藏营养液混合，控制含水率为40%
‑
80%；（4）添加保藏剂；（5）低温冷冻保藏。该法通过在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，可以提高菌体活性和耐低温能力，经低温冷冻藏后能够快速恢复活性。但是也需添加保藏剂且采用冷冻保藏，保藏成本相对较高。
[0007]CN108117992A公开了一种反硝化菌的常温保藏方法，包括（1）将反硝化菌培养至对数生长期，并收集菌体；（2）配制保藏营养液，主要包括碳源、氮源和微量物质等；（3）步骤（1）反硝化菌与步骤（2）保藏营养液于保藏容器中混合，加入适量保藏助剂，所述保藏助剂包括糖脂、糖醇和有机酸盐；（4）将步骤（3）混合液密封培养4
‑
12h，常温保藏。该方法具有常温保存效果好、存活率高、活性恢复快等优点。但是，该方法也需要添加特定组成的保藏营养液。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种硝化细菌的常温保藏方法。本专利技术采用藻菌共生方式实现菌体大批量常温保藏，具有常温保藏周期长、保藏活性好、恢复速度快等优点。
[0009]本专利技术提供的一种硝化细菌的常温保藏方法，包括如下步骤：（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，收集菌体；（2）将菌体和微藻投加至保藏液中，进行保藏；保藏条件为室温、光暗交替培养，日光照总时间高于8h；（3）保藏结束后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，得到活性稳定的硝化菌。
[0010]本专利技术中，步骤（1）硝化细菌培养采用本领域常规培养方法，如SBR法等。硝化细菌的曝气培养条件为：温度15～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧浓度为1
‑
5mg/L。
[0011]本专利技术中，步骤（1）硝化菌培养至生长稳定期，通过沉降、过滤、离心等方法收集获得的菌体。
[0012]本专利技术中，步骤（1）曝气培养采用的培养液中主要含氨氮和无机盐，其中NH
4+
‑
N浓度为 0.1
‑
1.5g/L，Fe
2+
浓度为0.01
‑
0.03g/L，K
+
浓度为0.05
‑
0.5g/L，Ca
2+
浓度为0.01
‑
0.05g/L，Mg
2+
浓度为0.05
‑
0.25g/L 。
[0013]本专利技术中，步骤（2）所述微藻为自养微藻，如可以是绿藻、硅藻、蓝藻等中任意一种，优选绿藻。微藻可以采用培养获得的微藻细胞，具体是将微藻培养至浓度为5
‑
10g/L时，收集藻细胞获得。
[0014]本专利技术中，步骤（2）所述菌体按照菌体质量与培养液的质量比为5
‑
20:100投加。
[0015]本专利技术中，步骤（2）所述微藻细胞的用量为硝化细菌菌体质量的1%
‑
10%。
[0016]本专利技术中，步骤（2）所述保藏液中，每1000mL水中含有氨氮0.3
‑
0.7g、锌盐0
‑
0.04g、钾盐0.06
‑
0.5g、碳酸钠0.6
‑
1.4g、钠盐20
‑
32g、镁盐0.2
‑
0.8g、钙0.8
‑
1.4g、碳酸氢钠0
‑
0.6g、维生素液1
‑
10mL，pH=8
‑
9。该保藏液适合硝化细菌的保藏，并有助于藻类生长代谢。
[0017]本专利技术中，步骤（2）所述的室温为5
‑
25℃。所述的光暗交替培养中，日光照总时间高于8h，光照培养可以一次完成，也可以分多次进行，每次光照时间不低于1h。
[0018]本专利技术中，步骤（3）保藏时间为0.5
‑
6个月，优选为1
‑
3个月。
[0019]本专利技术中，步骤（3）切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，所述培养液与步骤（1）培养液相同。
[0020]本专利技术中，步骤（3）曝气培养条件为：温度15～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧浓度为3
‑
5mg/L。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术采用藻菌共生方式能够实现硝化细菌批量常温保藏，具有常温保藏周期长、保藏活性好等优点。
[0022]（2）本专利技术保藏结束后，通过切出上层藻液和将下部硝化细菌曝气培养的方式，特别是控制高的溶解氧浓度条件，淘汰微藻，不影响硝化菌的恢复性能。
[0023]（3）本专利技术保藏成本低，适合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硝化细菌的常温保藏方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，收集菌体；（2）将菌体和微藻投加至保藏液中，进行保藏；保藏条件为室温、光暗交替培养，日光照总时间高于8h；（3）保藏结束后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，得到活性稳定的硝化菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）硝化细菌的曝气培养条件为：温度15～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧浓度为1
‑
5mg/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）曝气培养采用的培养液中主要含氨氮和无机盐，其中NH
4+
‑
N浓度为 0.1
‑
1.5g/L，Fe
2+
浓度为0.01
‑
0.03g/L，K
+
浓度为0.05
‑
0.5g/L，Ca
2+
浓度为0.01
‑
0.05g/L，Mg
2+
浓度为0.05
‑
0.25g/L 。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述微藻为自养的绿藻、硅藻、蓝藻中任意一种，优选绿藻。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：步骤（2）将微藻培养至浓度为5
‑
10g/L时，收集藻细胞获得。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述菌体按照菌体质量与培养液的质量比为5

【专利技术属性】
技术研发人员：孙丹凤，高会杰，陈明翔，王刚，李宝忠，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：