一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201818。本发明专利技术制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本发明专利技术的灭活疫苗免疫雏鸭后，雏鸭可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，对鸭群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产。

An inactivated vaccine for prevention and treatment of new duck reovirus and its preparation method

The invention discloses an inactivated vaccine for prevention and treatment of new duck reovirus and a preparation method thereof. The inactivated vaccine contains an effective amount of inactivated duck reovirus strain virus liquid for prevention or treatment, and the preservation number of the duck reovirus strain is CCTCC NO: V201818. The new inactivated duck reovirus vaccine prepared by the invention has good safety, no local and systemic adverse reactions caused by the vaccine, and the detection of various indicators is stable and effective. After immunizing ducklings with the inactivated vaccine of the invention, ducklings can obtain high antibody level, have a long duration and can be targeted at. It can provide effective immune protection for ducks, simplify the production process of vaccine, and realize large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
呼肠孤病毒的基因组为双股分节段的RNA，1978年国际病毒分离委员会(ICTV)将其定为呼肠孤病毒科(Reoviridae)，包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属。呼肠孤病毒(Avianreovirus)首次在鸡的呼吸道内分离得到，感染易感鸡后，可表现为肌腱炎、滑膜炎和呼吸道疾病等症状。ARV可感染鸡、火鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鸽子等禽类，可引起鸡的病毒性关节炎、腱鞘炎，同时也是其他病的病因，包括心肌炎、心包炎、心包积水、肝炎、胸腺萎缩、呼吸道病以及生长受阻等。2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭跗关节肿胀，跗关节常含有少量黄色或血样渗出物；严重病例，关节腔中有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度的跛行。该病主要导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸭呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，现有市售的鸭呼肠孤病毒疫苗无法对该病进行有效的防控；常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。而相较于弱毒疫苗，灭活疫苗比较安全、生产简单且易于保存。因此，急需研制一种安全高效能预防该新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，用于预防鸭群爆发新型呼肠孤病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。本专利技术的另一目的是提供该防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术是基于从具有严重跗关节肿大症状的患鸭肌腱组织中分离得到的一株新型鸭呼肠孤病毒，保藏编号为CCTCCNO：V201818，在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。本专利技术的第一方面，提供一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCCNO：V201818。优选的，鸭呼肠孤病毒株病毒液由如下方法制备而成：将保藏编号为CCTCCNO：V201818的鸭呼肠孤病毒株接种到鸡肝癌细胞(LMH)细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鸭呼肠孤病毒株病毒液。优选的，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。进一步的，所述防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗中还含有佐剂。本专利技术的第二方面，提供上述灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将保藏编号为CCTCCNO：V201818的鸭呼肠孤病毒接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；(2)将鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按1:1混合均匀，乳化，得到防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗。优选的，步骤(1)中，纯化的具体方法为：将收获的病毒液，5000r/min离心5min以去除细胞碎片等杂质，随后采用60000r/min超速离心2h，离心结束后用DMEM培养基重悬。优选的，步骤(2)中，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。优选的，步骤(2)中，所述水相中Tween-80的终浓度为2％-4％。优选的，步骤(2)中，所述白油、硬脂酸铝和Span-80的比例为94:2:6。优选的，步骤(2)中，油相和水相混合的方法为：将水相加入到油相中，6000rpm混合10min。优选的，步骤(2)中，所述乳化具体为：8000r/min乳化20min。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术利用从发病雏鸭体内分离得到的一株新型鸭呼肠孤病毒，该新型鸭呼肠孤病毒株具有优异的免疫原性，将该毒株接种到对呼肠孤病毒易感的LMH细胞系中，收获细胞毒液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的灭活疫苗，有利于当前大范围爆发的以跗关节肿大为主要症状的鸭呼肠孤病毒感染的防控。(2)本专利技术制备的新型鸭呼肠孤病毒灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，并且各项指标检测均稳定有效，利用本专利技术的灭活疫苗免疫雏鸭后，雏鸭可以获得较高的抗体水平，持续期长，可以有针对性的防治新型鸭呼肠孤病毒的感染与爆发，对鸭群提供有效的免疫保护；同时简化了疫苗的生产工艺，可以实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。附图说明图1：本专利技术的病毒分离株在LMH细胞上的细胞病变；其中，A：正常生长状态下的LMH细胞；B：N-DAV-SD16在LMH细胞上出现的CPE。图2：PCR鉴定结果；其中，M为Marker；泳道1为待测样品；泳道2为空白对照。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
所介绍的，2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病。该病的症状不同于以往的鸭呼肠孤病毒感染，首次在鸭群中出现了跗关节肿大的症状，由此推知，该传染性疾病可能是由新型呼肠孤病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸭呼肠孤病毒感染的药物和方法。采用鸭呼肠孤病毒灭活疫苗接种是防治该呼肠孤病毒感染与爆发的有效措施，但前提是需要分离获得免疫原性优异的鸭呼肠孤病毒毒株。由于呼肠孤病毒为RNA病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性上存在一定的差异，在遗传进化时，容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的以跗关节肿大为主要症状的禽呼肠孤病毒感染。本申请专利技术人从发病鸭肿胀的肌腱组织中分离出一株鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16，禽类呼肠孤病毒基因由分节段的10个基因片段(包括：L1-L3、M1-M3、S1-S4)组成，本专利技术对上述新分离的鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-DAV-SD16的10个基因片段中L1、L2、L3、M1、M2、S3、S4均位于一个相对独立的分支中，且与目前已经上传在Genbank中鸭源呼肠孤病毒同源性较低，说明新分离的毒株N-DAV-SD16不同于其他的禽呼肠孤病毒，可以认定本专利技术中所发现的鸭呼肠孤病毒与现有已经报道的鸭呼肠孤病毒存在较大变异，为正呼肠孤病毒属的1个单独种。经过进一步比对发现，该新型鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16基因组中重组了部分导致肉鸡跗关节肿胀的肉鸡源呼肠孤病毒的S1基因片段。并将该新型鸭呼肠孤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201818。利用现有的呼肠孤病毒灭活疫苗进行免疫，对该新型鸭呼肠孤病毒的预防和治疗效果非常不理想。本专利技术在该分离株的基础上，研本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V201818。

【技术特征摘要】
1.一种防治新型鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有预防或治疗上有效量的灭活的鸭呼肠孤病毒株病毒液；所述鸭呼肠孤病毒株的保藏编号为CCTCCNO：V201818。2.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述鸭呼肠孤病毒株病毒液由如下方法制备而成：将保藏编号为CCTCCNO：V201818的鸭呼肠孤病毒株接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鸭呼肠孤病毒株病毒液。3.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，鸭呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。4.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗中还含有佐剂。5.权利要求1-4任一项所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将保藏编号为CCTCCNO：V201818的鸭呼肠孤病毒接种到LMH细胞系中，对鸭呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鸭呼肠孤病毒株病毒液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁有祥，唐熠，高斌，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37