一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程及分子免疫学技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，该亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还具体公开了该草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法及其作为抗草鱼呼肠孤病毒感染疫苗用于提高草鱼感染草鱼呼肠孤病毒后鱼体的存活率。本发明专利技术中草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗为新型抗原蛋白疫苗，其制备方法简单，成分明确，安全稳定，能够诱导草鱼鱼体产生较高的非特异性和特异性免疫应答，进而获得较好的免疫保护效果。

A subunit vaccine of grass carp reovirus VP35 protein and its preparation method and Application

The invention discloses a subunit vaccine of the grass carp reovirus VP35 protein and its preparation method and application, which belongs to the field of genetic engineering and molecular immunology. The technical scheme of the present invention is as follows: a subunit vaccine of the grass carp reovirus VP35 protein, and the sequence of the subunit vaccine protein, as shown by the sequence list SEQ ID No.1. The invention also discloses the preparation method of the subunit vaccine of the grass carp reovirus VP35 protein and the survival rate of the fish body as an anti grass carp reovirus infection vaccine to improve the fish body after the grass carp infection of the grass carp reovirus. In the present invention, the grass carp reovirus VP35 protein subunit vaccine is a new antigen protein vaccine. The preparation method is simple, the composition is clear, the safety and stability of the vaccine can induce the grass carp fish to produce a higher non specific and specific immune response, and thus the better immune protection effect can be obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程及分子免疫学
，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
我国水产养殖以淡水鱼类为主，其中草鱼（Ctenopharyngodonidellus）养殖是淡水养殖中重要的组成部分，也是国内养殖量最大的鱼类。草鱼由于饲料来源广、生长速度快及经济价值高而广受养殖人员的喜爱，养殖范围广且规模大。但草鱼抗病能力差，各个阶段都易受到病害感染，常见疾病有草鱼肠炎病、赤皮病、烂鳃病和病毒性出血病，其中由草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）引起的草鱼出血病是草鱼养殖中较为严重的传染病之一，对我国淡水养殖造成巨大的经济损失。目前市场上草鱼呼肠孤病毒的灭活疫苗和减毒活疫苗正逐步推广使用，而草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗仍没有应用，并且病毒疫苗主要针对的是I型草鱼呼肠孤病毒，当前在国内流行最广、毒力较强的是II型草鱼呼肠孤病毒。现有的传统疫苗不能满足草鱼养殖业的发展，所以寻找一种安全、稳定、成分明确的草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗具有非常广阔的发展前景和应用价值，对草鱼养殖业的经济发展、养殖环境的改善以及我国提出绿色可持续养殖理念具有重要意义。当前草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗的研究现状主要围绕草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP4-VP7研制，已经申报了一些专利，例如申请号为201110189906.9的专利公开了一种草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗的制备方法，采用sf9昆虫细胞增殖重组GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒（vAcGCRV-VP5/VP7）制备疫苗与应用；又如申请号为201310513653.5的专利公开了一种草鱼呼肠孤病毒II型S10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用。但以上疫苗主要针对I型草鱼呼肠孤病毒，近年来随不同地区病毒分离鉴定，越来越多的II型草鱼呼肠孤病毒强毒力株，如GCRVHZ08、GCRV-GD108、GCReV109等不断被发现，而目前针对II型草鱼呼肠孤病毒的疫苗种类数量极少，已不能满足生产实际需要。为了适应生态渔业生产需求，以促进草鱼养殖业可持续健康发展，本专利技术的目的是寻找一种新型的抗原蛋白，为草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗提供更多的候选疫苗蛋白。通过生物信息学的技术方法和实验验证，发现II型草鱼呼肠孤病毒S11节段编码的VP35蛋白具有CxxC-n16-HxC锌指结合基序，是病毒外衣壳蛋白的主要成分，并且具有良好的免疫原性，能够刺激鱼体产生保护性的中和抗体，因此本专利技术将VP35蛋白制备成了亚单位疫苗，并验证了其应用效果。目前，未见利用草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白制备亚单位疫苗的相关报道。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法，该亚单位疫苗能够有效预防草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQIDNo.1所示。本专利技术所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示。本专利技术所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：（1）质粒VP35-pET32a的构建：以草鱼呼肠孤病毒的双链RNA基因为模板，通过反转录获得cDNA，用引物F1和R1进行PCR扩增，产物纯化后用KpnI和HindIII双酶切，回收1kp片段，同时将质粒pET32a(+)用KpnI和HindIII双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后在含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，筛选含有VP35-pET32a的阳性菌液，引物F1为：5’-TCGGGTACCATGGAACCAGCAAAACC-3’，引物R1为：5’-ATAAGCTTGGTACTGTCCCTGGATCTCAGG-3’；（2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将含有VP35-pET32a的阳性菌液在含氨苄的LB液体培养基上于37℃培养过夜活化，按体积比1:100将培养液转接到新鲜的含氨苄LB液体培养基上，于37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度1mMIPTG，继续培养6小时，离心收集菌体并用结合缓冲液悬浮，超声波破碎1小时，离心收集沉淀，并溶解在含6M脲的结合缓冲液中，冰上过夜，将溶解上清用Ni-IDA琼脂糖凝胶柱收集回收并透析，最终得到由序列表SEQIDNo.1的基因序列编码的亚单位疫苗蛋白。本专利技术所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述VP35蛋白作为抗草鱼呼肠孤病毒感染疫苗用于提高草鱼感染草鱼呼肠孤病毒后鱼体的存活率。本专利技术所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述VP35蛋白亚单位疫苗免疫草鱼鱼体后，通过刺激鱼体免疫细胞增殖、诱导鱼体抗病毒基因上调表达以及刺激鱼体特异性抗体产生以提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病。进一步优选，所述鱼体免疫细胞为单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞，所述鱼体抗病毒基因为IFNI、MHCI、IgM和TLR22。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术中草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗为新型抗原蛋白疫苗，其制备方法简单，成分明确，安全稳定，能够诱导草鱼鱼体产生较高的非特异性和特异性免疫应答，进而获得较好的免疫保护效果。附图说明图1为草鱼呼肠孤病毒S11目的基因与pET32a质粒酶切电泳图，其中1为草鱼呼肠孤病毒S11目的基因，2为pET32a质粒，M为DNA分子量标准；图2为亚单位疫苗蛋白在大肠杆菌的诱导表达条件优化，其中1-3分别为IPTG终浓度为0.5mM分别诱导2、4、6h的表达情况，4-7分别为IPTG终浓度为1mM分别诱导2、4、6h的表达情况，M为蛋白分子量标准；图3为纯化亚单位疫苗蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准，1为未加IPTG诱导的菌株，2为IPTG诱导的菌株，3为透析后的亚单位疫苗蛋白；图4为亚单位疫苗蛋白免疫鱼体后不同时间点白细胞数量变化，其中代表对照组，代表疫苗组，*代表显著高于对照组，P<0.05；图5为亚单位疫苗蛋白免疫鱼体后不同时间点淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的百分比变化；图6为草鱼主要免疫器官头肾和脾脏中的免疫基因IFNI、MHCI、IgM和TLR22的相对表达量变化；图7为亚单位疫苗蛋白免疫保护鱼体后血清中特异性抗体效价的变化；图8为亚单位疫苗蛋白对草鱼免疫保护后的攻毒试验的相对保护率，其中▲代表疫苗组，●代表对照组。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例1草鱼呼肠孤病毒V35蛋白亚单位疫苗表达载体的构建草鱼呼肠孤病毒分离自河南省新乡市一个养殖池塘，取患草鱼出血病的草鱼内脏，加PBS缓冲液混合研磨匀浆后，取匀浆液8000g离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQIDNo.1所示。2.一种权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示。3.一种权利要求1或2所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：（1）质粒VP35-pET32a的构建：以草鱼呼肠孤病毒的双链RNA基因为模板，通过反转录获得cDNA，用引物F1和R1进行PCR扩增，产物纯化后用KpnI和HindIII双酶切，回收1kp片段，同时将质粒pET32a(+)用KpnI和HindIII双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后在含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，筛选含有VP35-pET32a的阳性菌液，所述引物F1为：5’-TCGGGTACCATGGAACCAGCAAAACC-3’，引物R1为：5’-ATAAGCTTGGTACTGTCCCTGGATCTCAGG-3’；（2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将含有VP35-pET32a的阳性菌液在含氨苄的L...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔祥会，高岩，裴超，孙效迎，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41