本发明专利技术提供一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗，包含有灭活的四种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为保藏编号为CCTCC NO:V201908的BB18株、保藏编号为CCTCC NO:V201909的HeB18株和保藏编号为CCTCC NO:V201910的SD18株和S1133株。本发明专利技术所提供的四价灭活疫苗能够对我国白羽肉鸡呼肠孤病毒不同血清型的分离株提供完全保护，从而减少养殖业的损失。
A Tetravalent Inactivated Reovirus Vaccine for White Feather Broilers
The invention provides a Tetravalent Inactivated Vaccine for white feather broiler reovirus, which contains four inactivated virus strain antigens and vaccine adjuvants. The antigen is BB18 strain with preservation number CCTCC NO: V201908, HeB18 strain with preservation number CCTCC NO: V201909 and SD18 strain with preservation number CCTCC NO: V201910 and S133 strain. The Tetravalent Inactivated vaccine provided by the invention can provide complete protection for the isolates of different serotypes of reovirus of white feather broilers in China, thereby reducing the losses of the breeding industry.
【技术实现步骤摘要】
一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗
本专利技术属于禽类疫苗制备
，具体涉及一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗。
技术介绍
近年来白羽肉鸡呼肠孤病毒在我国某些地区的白羽肉鸡养殖场中呈区域性流行，引起的临床表现与传统的的呼肠孤病毒(白羽肉鸡呼肠孤病毒典型株S1133鸡病毒性关节炎病毒)感染有一定差异。主要表现为病鸡瘫痪、不愿走动，腱鞘炎、腓肠肌腱断裂，跗关节肿大、出血、发青直至形成黄白色纤维样干酪物，严重影响鸡群生产成绩，给我国的养鸡业造成重大损失。现有疫苗的免疫效果下降，可能与呼肠孤病毒发生变异有关。呼肠孤病毒属于双链RNA病毒，点突变的快速积累是RNA病毒的一个代表性特征，由基因突变和重组而引起的抗原漂移在呼肠孤病毒中时有发生，最终导致新的毒株出现和疫苗失效。目前鸡病毒性关节炎由经典Ⅰ群S1133类血清型疫苗防控，这些疫苗在世界上大部分地区已被证明是有效的。然而，针对抗原性上有差异的鸡呼肠孤病毒不同分离株，S1133类血清型疫苗只能提供部分保护。由于活疫苗的研制周期较长并且很难达到预期的效果，因此，筛选变异的新型鸡呼肠孤病毒并制备疫苗对于白羽肉鸡呼肠孤病毒病的防控具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗，从而弥补现有鸡呼肠孤病毒疫苗的不足。本专利技术提供一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗，包含有灭活的四种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为保藏编号为CCTCCNO:V201908的BB18株、保藏编号为CCTCCNO:V201909的HeB18株和保藏编号为CCTCCNO:V201910的SD18株和S1133株；其中四种病毒株的病毒含量不低于4×107.0TCID50/0.1ml；其中病毒株是使用甲醛溶液进行灭活。所述的疫苗佐剂为油相佐剂，其一种组成是94份兽用白油，1份硬脂酸铝、5份司本-80。本专利技术的四价灭活疫苗，其制备方法如下：1)病毒增殖及收获：将BB18株、HeB18株、SD18株和S1133株在鸡胚成纤维细胞CEF上进行病毒繁殖，获得病毒液；2)病毒的浓缩：将收获的4种病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，浓缩的病毒液准备进行灭活；3)病毒灭活：将浓缩的病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％；37℃摇床内，200rpm震荡灭活20小时后取出，放2～8℃保存；4)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；5)水相制备将步骤3)灭活的鸡呼肠孤病毒SD18株、BB18株、HeB株和S1133株抗原液各96份分别与灭菌后的4份吐温-80混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解；6)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min进行乳化制成疫苗。本专利技术所提供的四价灭活疫苗能够对我国白羽肉鸡呼肠孤病毒不同血清型的分离株提供完全保护，从而减少养殖业的损失。附图说明图1：免疫鸡呼肠孤病毒疫苗的父母代种鸡所产雏鸡母源抗体的中和抗体滴度变化规律图；其中横坐标是雏鸡日龄，纵坐标是中和抗体滴度。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：病毒株的分离及鉴定申请人筛选获得了3株白羽肉鸡呼肠孤病毒，在对应的发病鸡群的父母代种鸡均免疫过鸡病毒性关节炎活苗S1133株和油苗S1133株+1733株+2408株，经测定父母代种鸡开产前血清呼肠孤病毒抗体以及它们的商品代白羽肉鸡1日龄血清呼肠孤病毒母源抗体抗体均为强阳性(有效中和抗体效价≥5.0log2)，理论上，此中和抗体水平完全可以阻断对型经典Ⅰ群S1133类毒株野毒的攻击，从而使鸡群不发病，但是临床上不同日龄的父母代和商品代鸡群仍然发生鸡呼肠孤病毒感染，说明鸡病毒性关节炎经典毒株疫苗S1133株、1733株和2408株产生的抗体不能够对目前的肉鸡呼肠孤病毒变异株提供完全保护作用。最终从患有瘫痪的白羽肉鸡病鸡病例中成功分离鉴定并纯化到3株白羽肉鸡呼肠孤病毒，分别命名为BB18株、HeB18株、SD18株，经鉴定分别定义为鸡呼肠孤病毒Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ群，与传统的Ⅰ群鸡呼肠孤病毒S1133在基因序列、抗原性和致病性上存在很大差异，尤其在抗原性上，血清交叉中和试验表明不同毒株之间存在明显的差异，分属于不同的血清型。使用分离到的白羽肉鸡呼肠孤病毒和经典株S1133株来制备四价灭活疫苗。鸡呼肠孤病毒BB18株已于2019年2月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:V201908；鸡呼肠孤病毒HeB18株已于2019年2月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:V201909；鸡呼肠孤病毒SD18株已于2019年2月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:V201910.鸡呼肠孤病毒S1133购自中国兽医药品监察所。实施例2：疫苗的制备及检测1、疫苗的制备1.1鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备：取9日龄SPF鸡胚，用碘酒消毒气室部位蛋壳，再用75％酒精脱碘消毒，剪碎气室部位蛋壳，取出鸡胚，剪断鸡胚与卵黄连接的脐带，将鸡胚放置干净的平皿上。倒入适量微温的PBS液，除去头、翅膀、腿和胚体内脏器官，将剩余胴体用PBS液清洗3次。用剪刀将组织剪成1mm3左右的小块，用PBS液洗涤3次。加入适量37℃水浴加热的0.25％胰酶溶液，水浴锅中消化25～30min。时间到后，加入10％血清的DMEM培养基终止消化，离心去掉上清，加入无血清的DMEM溶液来回吹打，使细胞散开，将组织细胞悬液经200目和400目细胞筛后，收集过筛液，1500rpm离心10min，弃掉上清，用8％血清的DMEM培养基将沉淀的细胞重悬，按照1×106/ml的细胞密度接种于细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下进行培养。1.2病毒增殖及收获：将本实验室先前成功分离鉴定并纯化到3株白羽肉鸡呼肠孤病毒(BB18株、HeB18株、SD18株)以及经典S1133株在鸡胚成纤维细胞(CEF)上进行病毒繁殖，以获得足量滴度高且纯净的病毒液。将制备的CEF细胞培养过夜后，待细胞密度达到85％左右，倒掉瓶内细胞培养液，用无血清的DMEM培养基洗涤三次，按照1％剂量接种病毒，37℃吸附1h，期间每隔10min轻轻摇摆细胞瓶，以使病毒吸附完全，吸附完毕后倒掉接毒液，加入1％胎牛血清的DMEM培养基连续培养并观察，48h-60h后细胞病变达到80％-90％左右进行收毒，将细胞瓶放入-80℃超低温冰箱，反复冻融三次，使病毒完全从细胞内释放出来，4℃离心机内5000rpm离心30min，小心的将上清液转移至无菌瓶内。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验。标记好编号SD18株、BB18株、HeB18株、S1133株，4℃保存备用。1.3病毒的浓缩：将收获的4种病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，浓缩4倍，留样，进行半成品检验，其余病毒液随即进行灭活。1.4病毒灭活将鸡呼肠孤病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有灭活的四种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为保藏编号为CCTCC NO:V201908的BB18株、保藏编号为CCTCC NO:V201909的HeB18株和保藏编号为CCTCC NO:V201910的SD18株和呼肠孤病毒S1133株。
【技术特征摘要】
1.一种白羽肉鸡呼肠孤病毒四价灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有灭活的四种病毒株抗原和疫苗佐剂，其中抗原为保藏编号为CCTCCNO:V201908的BB18株、保藏编号为CCTCCNO:V201909的HeB18株和保藏编号为CCTCCNO:V201910的SD18株和呼肠孤病毒S1133株。2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒株是使用甲醛溶液进行灭活。3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒株的病毒含量分别不低于4×107.0TCID50/0.1ml。4.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为油相佐剂，其一种组成是94份兽用白油，1份硬脂酸铝、5份司本-80。5.权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)病毒增殖及收获：将BB18株、HeB18株、SD18株和S1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李陆梅，宫晓，于可超，张青，张玉杰，邹敏，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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