一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，所述疫苗包括：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪轮状病毒VP7蛋白。该疫苗使用真核表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，保护效果好，对动物没有致病性，并且本发明专利技术的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。

Preparation and application of a porcine rotavirus subunit vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用
本专利技术属于动物疫苗
，尤其涉及一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
猪轮状病毒(PorcineRotavirus,PRV)属于呼肠病毒科轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一，主要感染1-4周龄仔猪，具有发病率高、分布广泛的特点。目前预防猪轮状病毒感染的主要方法是疫苗接种，应用疫苗免疫已经成为降低相关发病率、病死率和减轻经济负担的一个重要途径。目前市场上常见疫苗有强毒灭活苗和弱毒活疫苗，但由于轮状病毒的多型性；以及减毒苗与野毒株基因重组,引起回复突变等，这些因素都给该病的防疫造成巨大困难。猪轮状病毒VP7蛋白是轮状病毒(RV)粒子表面的外壳蛋白，即建立病毒体外层表面的糖蛋白，VP7蛋白被免疫力(immunity)当作是防止感染的途径，也是PRV主要的中和抗原，可以引起机体产生中和抗体，起到免疫保护作用。本专利技术因此而来。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术的不足，提供一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，以解决现有技术中存在的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种免疫组合物，包含：采用序列如SEQIDNO:1所示的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪轮状病毒VP7蛋白。本专利技术一个较佳实施例中，所述猪轮状病毒VP7蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。本专利技术还公开了所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术还公开了所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。本专利技术的另一目的在于提供了一种免疫组合物的制备方法，包括以下步骤：S1、将密码子优化后的猪轮状病毒VP7蛋白编码基因克隆到真核表达载体中，得到含有VP7蛋白编码基因的重组质粒；S2、将步骤S1中所述的重组质粒转染CHO细胞，得到重组CHO细胞株；S3、通过培养、筛选、驯化步骤S2中所述的重组CHO细胞株，得到稳定且能够高度表达重组猪轮状病毒VP7蛋白的重组CHO细胞株；S4、对S3步骤中所述的重组CHO细胞株进行发酵培养，纯化后得到重组猪轮状病毒VP7蛋白。本专利技术还提供了所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术还提供了所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。本专利技术还公开了一种蛋白，其包括以下组成的组：SEQIDNO:2的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供所述的蛋白用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。本专利技术的另一目的在于提供所述的蛋白用于生产用于检测猪轮状病毒相关诊断试剂的用途。本专利技术解决了
技术介绍
中存在的缺陷，本专利技术具备以下有益效果：本专利技术公开了一种猪轮状病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，该疫苗能在动物体内产生较强的体液免疫，能够激发更强更全面的抗体保护；本专利技术构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达重组猪轮状病毒VP7蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株表达VP7蛋白产量高，大大降低了疫苗生产成本；本专利技术的重组猪轮状病毒VP7蛋白生产过程不涉及全病毒，具有天然安全性，本专利技术使用的载体有谷氨酰胺合成酶(GlutamineSynthetase，GS)筛选扩增系统，可以增加目的基因拷贝数，通过CHO细胞进行表达，分泌到上清中，易于纯化，哺乳动物细胞真核表达，表达糖基化修饰完善，最接近本身蛋白分子，悬浮培养，易于大规模生产；本专利技术的猪轮状病毒亚单位疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且本专利技术的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明；图1为将PRV-VP7基因经PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，可以看到在0.9kbp附近出现条带，其中1为PRV-VP7基因，2为阴性对照，M为分子量标记；图2为多个PRV-VP7基因转化的菌落样品经PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，在0.9kbp条带附近出现为阳性样品，其中1-5均为PRV-VP7基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；图3为构建的真核表达载体pCI-VP7-GS图谱；图4为实施例2中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约34kDa附近出现条带，其中1为实施例2中收获的细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；图5为实施例3中重组CHO上清样品WesternBlot检测结果，其中1为阴性对照，2为重组CHO细胞上清样品，M为分子量标记；图6为蛋白纯化后的结果，其中1为上样，2为流穿，3为洗脱，4-7为不同浓度洗脱后样品，M为分子量标记；图7为攻毒后对照组猪解剖结果。具体实施方式现在结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细的说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。本专利技术中VP7蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列，使用载体可以包括但不限于pSV2-GS，pCI-GS，pcDNA4-GS，优选的用pCI-GS。CHO细胞系可以是为DG44，DXB11，CHO-K1，CHO-S细胞株，优选的CHO-S，但不限于此。佐剂优选自MONTANIDEISA15、MONTANIDEISA206VG、MONTANIDEGEL01的一种或者两种以上的组合。实施例1重组真核表达载体pCI-VP7-GS的构建1.1、pUC-VP7质粒载体的构建密码子优化的VP7基因来自南京金斯瑞生物科技有限公司，并克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-VP7质粒载体。优化后的VP7基因序列如SEQIDNO.1所示。1.2、VP7基因扩增以pUC-VP7作为模板，VP7-F、VP7-R作为引物进行PCR扩增(VP7-F的基因序列如SEQIDNO.3所示；VP7-R的基因序列如SEQIDNO.4所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。表1VP7基因扩增体系将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在0.9kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。1.3、酶切本实施例采用的真核表达载体为pCI-GS，将pCI-GS质粒和纯化后的VP7基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。表2VP7基因酶切反应体系表3pCI-GS质粒酶切反应体系1.4、连接将酶切过的pCI-GS质粒和VP7基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。表4VP7基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫组合物，其特征在于：包含：采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪轮状病毒VP7蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种免疫组合物，其特征在于：包含：采用序列如SEQIDNO:1所示的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪轮状病毒VP7蛋白。2.根据权利要求1所述的一种免疫组合物，其特征在于，所述猪轮状病毒VP7蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪轮状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。4.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪轮状病毒感染的药剂的用途。5.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将密码子优化后的猪轮状病毒VP7蛋白编码基因克隆到真核表达载体中，得到含有VP7蛋白编码基因的重组质粒；S2、将步骤S1中所述的重组质粒转染CH...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，易小萍，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32