一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞膜色谱领域，具体是一种新型的APTES修饰的硅胶应用细胞膜色谱中。本发明专利技术经APTES处理后的硅胶具有更高的柱效，大大加强了细胞膜与硅胶的结合力，柱寿命至少延长至12天。另外在柱效下降最快的前3天时间里，其重现性也由以前的20％提高到10％以内。这样的改进十分适用于珍稀或较难以获得的生物材料，可以极大减少生物材料的用量和浪费。

【技术实现步骤摘要】
一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱及其制备方法和应用
本专利技术涉及细胞膜色谱
，具体地说，是一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞膜色谱法(Cellmembranechromatography,CMC)结合了生物材料和色谱法的优势，使从复杂体系中筛选出有效的活性成分成为可能。它的原理很简单，就是将细胞膜固定在固定相上，将复杂体系(如中药等)的提取溶液进样到细胞膜色谱模型中，然后用质谱或其他检测器研究所有化合物的保留行为。化合物的保留行为越强，说明其是活性成分的可能性就越大，与其他的亲和色谱原理类似。本课题组已经成功的建立了一系列的CMC模型，并成功搭建了一个在线全二维细胞膜色谱筛选系统。一般来说，细胞膜和硅胶是通过疏水性相互作用结合的。这种结合力比较弱且不稳定，这使得细胞膜很容易从硅胶上脱落，从而导致细胞膜色谱柱寿命短，柱效低。由于色谱固定相上细胞膜的老化和脱落，该模型存在着寿命短、重复性差等缺点。这些缺点很大程度上限制了该模型的推广、应用。尤其是对于一些较为珍稀的细胞种类，其细胞量较少或较难以培养，较难以满足实际的活性筛选要求。这些问题大大的限制了该模型的进一步推广应用。亲和色谱也曾经面临过相似的问题，并通过使用共价键合的方式将蛋白固定在固定相表面，解决了生物材料易脱落的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术采用了一种新型的APTES修饰的硅胶应用于CMC中。APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)，分子式是C9H23NO3Si，结构式为本专利技术利用APTES作为桥梁，在硅胶表面键合了醛基，该醛基可以与细近年来，肿瘤干细胞的研究引起了人们的广泛关注。它们是一种具有自我更新能力的特殊肿瘤细胞，在肿瘤的复发、转移和迁移中发挥着重要作用。杀死肿瘤干细胞将会显著提高肿瘤的治愈率，同时也大大降低肿瘤的复发率。但是通常来说分离和培养肿瘤干细胞是十分困难且耗时的过程。而我们新建立的APTES修饰的细胞膜色谱寿命长、效率高，十分适用于肿瘤干细胞。因此在本专利技术中，我们通过APTES修饰的硅胶建立了一种新的APTES修饰的HepG2肿瘤干细胞的细胞膜色谱(Cancerstemcellmembranechromatography,CSCMC)，简称HepG2/CSCMC色谱柱。为了证实这个新的模型的有效性，我们进行了一系列的研究，包括柱效、柱寿命和选择性等。在本专利技术中，我们选择一种著名的中药丹参，作为理想的复杂体系进行活性成分筛选。有报道研究证明，在1981至2006年之间，临床上70％的新批药物来源于天然产物。因此从中药中筛选出潜在的具有抗肿瘤干细胞的活性成分是一项很有前景的研究。此外，我们还拟采用全二维色谱法，以进一步提高CMC的分离度。在这些条件下，我们搭建了一个经APTES共价修饰的HepG2肿瘤干细胞细胞膜色谱全二维分析系统，对丹参中的活性成分进行了筛选。再结合后期的药效试验确证，如细胞杀伤和细胞凋亡实验等，这将是一个有效的从复杂的系统中筛选目标化合物的方法，特别是对于一些珍稀的、较难以获得的生物材料。研究结果表明，丹参酮IIA，隐丹参酮和二氢丹参酮I这三个成分在该色谱模型中有较强保留行为，后续的药理实验也证明它们的确是具有一定药效的活性化合物。本专利技术的第一方面，提供一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱的制备方法，包括以下步骤：a)合成APTES固定相：用APTES对二氧化硅硅胶的球体表面进行修饰，从而使硅胶表面上通过APTES和戊二醛的桥联，键合得到一端游离的醛基官能团；(C.-E.；Wiedmer,S.K.；J.-H.；Sakeye,M.；Lokajová,J.；Riekkola,M.-L.Journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis2012,71,1-10.)b)制备APTES修饰的细胞膜色谱柱：收集1×107至5×107(优选3.5×107)细胞，在110×g条件下离心10min，然后用PBS洗三次；然后加入PBS制成细胞悬液，细胞用超声波处理器破膜；得到的混悬液离心1000×g，10分钟；弃沉淀，然后上清液离心12000×g20min；得到的沉淀再用5mlPBS悬浮即得细胞膜悬浮液；细胞膜固定相(CMSP)是由细胞膜悬液真空搅拌条件下与0.04gAPTES硅胶反应制备；以上所有的程序均在4℃条件下进行；过夜孵育12h后，使用PBS在1000g，10分钟条件下清洗三次；所得沉淀再次用PBS混悬浮，用LC泵以PBS为流动相进行湿法装柱；装填得到的CMC柱(10mm×2mm内径)在0.2.mlmin-110mM醋酸铵的流速下保持37℃的温度平衡1h，直至柱压和基线平稳。CMC柱存放在4℃的醋酸铵中。所述的细胞膜色谱柱中的细胞为HepG2肿瘤干细胞或HepG2肿瘤细胞。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的细胞膜色谱柱中的细胞为HepG2肿瘤干细胞，所述的细胞膜色谱柱简称HepG2/CSCMC色谱柱。更优选的，所述的细胞膜色谱柱中的细胞为第三代HepG2肿瘤微球体。本专利技术的第二方面，提供一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱，所述的细胞膜色谱柱中的硅胶是经APTES处理后的硅胶，即用APTES对二氧化硅硅胶的球体表面进行修饰，使硅胶表面上通过APTES和戊二醛的桥联，键合得到一端游离的醛基官能团。优选的，所述的细胞膜色谱柱采用上述制备方法制备得到。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的细胞膜色谱柱中的细胞为HepG2肿瘤干细胞或HepG2肿瘤细胞。更优选的，所述的细胞膜色谱柱中的细胞为第三代HepG2肿瘤微球体。本专利技术的第三方面，提供一种经APTES修饰的全二维HepG2/CSCMC的分析系统，由安捷伦1200系列高效液相色谱系统、二元泵系统、单元泵系统、恒温箱、在线脱气机、自动进样器、电控十通阀组成，并由安捷伦MassHunter工作站控制(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA,USA)。HepG2/CSCMC色谱柱(内径10×2mm，5μm)作为第一维色谱，流动相为10mM醋酸铵溶液，流速为0.2ml.min-1。第二维色谱柱为ChromolithPerformanceRP-18emonolithic整体柱(100mm×4.6mm内径，默克，达姆施塔特，德国)，流动相为溶剂A(0.1％甲酸)和溶剂B(乙腈)，并以3.5ml.min-1的流速进行梯度洗脱。第二位色谱梯度设置如下：0～4min，10％B-30％B；4-9分钟，30％B-75％B；9-9.01min，75％B-10％B；9.01-10min，10％B。二维系统的具体运行方案在本课题组之前发表的论文中有详细的阐述(Chen,X.；Cao,Y.；Zhang,H.；Zhu,Z.；Liu,M.；Liu,H.；Ding,X.；Hong,Z.；Li,W.；Lv,D.Analyticalchemistry2014,86,4748-4757；Chen,X.；Cao,Y.；Lv,D.；Zhu,Z.；Zhang,J.；Chai,Y.JournalofChromatographyA2012,1242,67-74.)。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)合成APTES固定相：用APTES对二氧化硅硅胶的球体表面进行修饰，使硅胶表面上通过APTES和戊二醛的桥联，键合得到一端游离的醛基官能团；b)制备APTES修饰的细胞膜色谱柱：收集1×10

【技术特征摘要】
2016.10.19 CN 20161091217821.一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)合成APTES固定相：用APTES对二氧化硅硅胶的球体表面进行修饰，使硅胶表面上通过APTES和戊二醛的桥联，键合得到一端游离的醛基官能团；b)制备APTES修饰的细胞膜色谱柱：收集1×107至5×107细胞，在110×g条件下离心10min，然后用PBS洗三次；然后加入PBS制成细胞悬液，细胞用超声波处理器破膜；得到的混悬液离心1000×g，10分钟；弃沉淀，然后上清液离心12000×g20min；得到的沉淀再用5mlPBS悬浮即得细胞膜悬浮液；细胞膜固定相是由细胞膜悬液真空搅拌条件下与0.04gAPTES硅胶反应制备；以上所有的程序均在4℃条件下进行；过夜孵育12h后，使用PBS在1000g，10分钟条件下清洗三次；所得沉淀再次用PBS混悬浮，用LC泵以PBS为流动相进行湿法装柱；装填得到的CMC柱在0.2.mlmin-110mM醋酸铵的流速下保持37℃的温度平衡1h，直至柱压和基线平稳。2.根据权利要求1所述的利用APTES修饰的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，所述的细胞膜色谱柱中的细胞为HepG2肿瘤干细胞、或HepG2肿瘤细胞。3.根据权利要求1所述的利用APTES修饰的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，所述的细胞膜色谱柱中的细胞为第三代HepG2肿瘤微球体。4.一种利用APTES修饰的细胞膜色谱柱，其特征在于，所述的细胞膜色谱柱中的硅胶是经APTES处理后的硅胶，即用APTES对二氧化硅硅胶的球体表面进行修饰，使硅胶表面上通过APTES和戊二醛的桥联，键合得到一端游离的醛基官能团。5.根据权利要求4所述的利用APTES修饰的细胞膜色谱柱，其特征在于，所述的细胞膜色谱柱采用权利要求1-3任一所述的制备方法制备得到。6.一种经APTES修饰的全二维HepG2/CSCMC的分析系统，其特征在于，由安捷伦1200系列高效液相色谱系统、二元泵系统、单元泵系统、恒温箱...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁璇，陈啸飞，曹岩，刘悦，巩志荣，贾丹，王冬尧，陈郎东，王晓宇，赵亮，吕磊，张国庆，朱臻宇，洪战英，柴逸峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31