基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种基于RET基因构象变化引起荧光染料硫黄素T荧光强度变化的温度计的构建，具体为：将荧光染料硫黄素T（ThT）和RET按1:1的摩尔比混合，加入Tris‑HCl缓冲溶液，调整pH=7，8和9。本发明专利技术构建的体系对pH和温度有明显响应，尤其在pH为7、8、9时，随温度升高，ThT的荧光强度有规律的下降，据此可设计成温度计。因为人体内pH在7左右，所以针对pH=7，在25‑40℃之间，设计成“体温计”。

Method for constructing thermometer based on fluorescent dye ThT and RET gene

The invention relates to a RET gene based on the conformational changes caused by changes in construction, the thermometer fluorescent dye Thioflavin T fluorescence intensity in particular: fluorescent dye Thioflavin T (ThT) and RET in 1:1 molar ratio, adding Tris HCl buffer solution, adjust pH=7, 8 and 9. The system constructed by the invention has obvious response to pH and temperature, especially when pH is 7, 8 and 9, and the fluorescence intensity of ThT decreases regularly with the increase of temperature, so that the thermometer can be designed as a thermometer. Because the human body pH at around 7, so for pH=7, between 25 40 DEG C, designed as a \thermometer\.

【技术实现步骤摘要】
基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法
本专利技术涉及基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，基本为基于RET基因构象变化引起荧光染料ThT荧光强度变化来指示温度变化的温度计的构建方法。
技术介绍
温度计，是测温仪器的总称，可以准确的判断和测量温度。通常利用固体、液体、气体受温度的影响而热胀冷缩等的现象为设计的依据。有煤油温度计、酒精温度计、水银温度计、气体温度计、电阻温度计、温差电偶温度计、辐射温度计和光测温度计、双金属温度计等多种温度计。大多是利用物质的物理性质来设计温度计用于不同的环境中。RET蛋白是一种受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase),，一种原癌基因，对氢离子有响应，在弱酸环境里，会折叠成i-motif结构。人端粒存在富含胞嘧啶（C）的脱氧核苷酸（DNA）序列，这些序列在酸性环境中能通过胞嘧啶（C）与质子化胞嘧啶CH+之间的氢键相互作用形成平行双链，两条双链反平行相互插入所形成的四链非共价复合物，称为结构。结构多存在于原癌基因的启动子区域，如血管内皮生长因子、原癌基因以及成视网膜细胞瘤基因等，使其成为基因调控和抗癌药物设计的靶点。硫黄素T（ThT）又称碱性黄1，2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物，分子式是C17H19ClN2S，是一种化工染料。RET为发卡结构时，ThT与RET结合，有荧光发射，当RET变为i-motif结构时，ThT与RET分离，无荧光。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，高效灵敏、简单、快速的基于RET基因构象变化引起荧光染料ThT荧光强度变化来指示温度变化的温度计的构建方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，按下述步骤：第一，荧光染料ThT和RET基因摩尔比为1：1，在Tris-HCl缓冲溶液中培养形成体系，通过改变Tris-HCl缓冲溶液的pH值，分别控制体系的pH值为7、8和9；第二，在温度4-55℃范围内，每间隔3℃恒温培养30分钟；第三，检测荧光，参数设置为狭缝10nm，电压500V，获得各温度梯度荧光强度参数。本专利技术机理是：在弱酸性环境下，RET基因会折叠成i-motif结构，当RET基因为发卡结构时，在体系中荧光染料ThT与RET基因结合，处于发卡结构的空穴区内，ThT有荧光发射。所述的基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，在弱酸性环境下，利用RET基因会折叠成i-motif结构，RET基因在pH=7、8、9时随温度而发生构象变化的温度为Tm，当RET基因为发卡结构时，荧光染料ThT与RET基因结合，处于发卡结构的空穴区内，引起荧光染料ThT荧光强度的变化，对温度有明显响应。当温度升高超过其构象变化的温度时，ThT荧光强度下降，推测发卡结构解开变成单链结构，此时ThT与RET分离。本专利技术可利用上述的构建方法设计一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计。另外，根据人体的pH值7左右的特性，将pH值调至7，在25-40℃，每一度恒温培养30分钟。pH值调至与人体的pH值相近，设计温度在25-40℃的体温计，检测荧光强度，对每一度均有明显响应且能区分开，重复测试三次以上，取每度荧光强度的平均值，设计成可商用的“体温计”。而本专利技术主要探究了RET基因在pH=7、8、9时随温度而发生的构象变化，从而引起荧光染料ThT荧光强度的变化，发现对温度有明显响应，以此设计了温度计。本专利技术利用RET基因特性，与荧光染料ThT在Tris-HCl缓冲溶液中培养形成荧光体系，用于温度计。附图说明图1是pH=7时，4-55℃区间（间隔为3℃）的荧光发射曲线图；图2是pH=7时，4-55℃区间（间隔为3℃）的线性图；图3是pH=8时，4-50℃区间（间隔为3℃）的荧光发射曲线图；图4是pH=8时，4-55℃区间（间隔为3℃）的线性图；图5是pH=9时，4-55℃区间（间隔为3℃）的荧光发射曲线图；图6是pH=9时，4-55℃区间（间隔为3℃）的线性图；图7是pH=7时，25-40℃区间（间隔为1℃）的荧光发射曲线图；图8是pH=7时，25-40℃区间（间隔为1℃）的线性图；图9是pH=7时，25-40℃区间的循环图；图10本专利技术原理示意图。具体实施方式一种基于RET构象变化的温度计的构建方法，在弱酸性环境下，RET基因会折叠成i-motif结构，当RET基因为发卡结构时，荧光染料ThT与RET基因结合，处于发卡结构的空穴区内，ThT有荧光发射，如下图10所示左侧的结构示意图RET基因受温度影响会发生构象改变，当温度升高超过其构象变化的温度（Tm）时，推测发卡结构解开变成单链结构，此时ThT与RET分离，ThT荧光下降。如下图10右侧的结构示意。一，体系构建的准备：1.Tris-HCl缓冲液（Tris：10mM，pH=7、8、9）的配制：确称取Tris0.6057g于500mL烧杯中，用400mL三重蒸馏水将其完全溶解，用稀盐酸溶液调节pH分别至7、8、9，移液至500mL容量瓶。烧杯用三重蒸馏水洗涤三次，润洗液转移入容量瓶内，定容，混合均匀备用。2.将RETDNA用Tris-HCl缓冲溶液溶解，浓度为100μM。3.ThT存储液（50mL，100μM）的配制：准确称取ThT1.6mg，加入50mL三重蒸馏水将其溶解，混合均匀，4℃避光保存，备用，浓度即为100μM。实施例1基于荧光染料ThT、RET基因体系的例温度计构建：1.分别取10μLRETDNA（100μM），10μLThT(100μM)，980μL20mMTris-HCl(pH=7、8、9)，在间隔3℃温度下恒温培养30分钟。2.检测荧光，激发425nm下，在525nm处有明显荧光，体系在4-55℃区间随温度变化的荧光强度变化如图1至6所示。利用体系特性可用于制作温度计。实施例2在中性环境（pH=7）下，同一体系分别在25-40℃下每一度恒温培养30分钟，检验循环性。在25-40℃检测荧光强度，对每一度均有明显响应且能区分开，重复测试三次以上，如图7至9所示，本实施例重复测试六次，取每度荧光强度的平均值，设计成“体温计”。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，按下述步骤：第一，荧光染料ThT和RET基因摩尔比为1：1，在Tris‑HCl缓冲溶液中培养形成体系，通过改变Tris‑HCl缓冲溶液的pH值，分别控制体系的pH值为7、8和9；第二，在温度4‑55℃范围内，每间隔3℃恒温培养30分钟；第三，检测荧光，参数设置为狭缝10nm，电压500V，获得各温度梯度荧光强度参数。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，按下述步骤：第一，荧光染料ThT和RET基因摩尔比为1：1，在Tris-HCl缓冲溶液中培养形成体系，通过改变Tris-HCl缓冲溶液的pH值，分别控制体系的pH值为7、8和9；第二，在温度4-55℃范围内，每间隔3℃恒温培养30分钟；第三，检测荧光，参数设置为狭缝10nm，电压500V，获得各温度梯度荧光强度参数。2.根据权利要求1所述的基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，其特征在于：在弱酸性环境下，利用RET基因会折叠成i-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明茹，高如如，石硕，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海,31