一种酶型时间温度指示体系制造技术

本发明专利技术公开了一种酶型时间温度指示器体系，酶型时间温度指示器体系由两种酶和两种底物两部分组成；(1)所述的两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度范围分别为1～5μg/ml和0.05～0.2μg/ml，两种酶按照1：1～5:1的体积比加入体系中；(2)所述的两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺，两者加入的浓度为0.1～0.4mg/ml以及0.05～0.2mg/ml；(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖、3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。本发明专利技术是一种新型安全的色原试剂，常用作ELISA等免疫检测的显色剂，具有检测灵敏度高，稳定性好等优点，而且使用安全。

An enzyme type time temperature indicator system

The invention discloses an enzyme type time temperature indicator system, enzymatic time temperature indicator system consists of two enzymes and two substrates of two parts; (1) the two enzymes for glucose oxidase and horseradish peroxidase, the concentration range of two enzymes were 1 ~ 5 and 0.05 ~ g/ml 0.2 g/ml, two kinds of enzymes in accordance with 1:1 ~ 5:1 volume ratio is added to the system; (2) the two substrates to glucose and 3,3 ', 5,5' four methyl benzidine concentration, the adding is 0.1 ~ 0.4mg/ml and 0.05 ~ 0.2mg/ml; (3) the order of double double enzyme substrate adding system were: glucose, 3,3 ', 5,5' four methyl benzidine, horseradish peroxidase and glucose oxidase; (4) according to the concentration ratio and adding smoothly sequentially adding reaction at different temperatures, the reaction after a period of time measured absorbance. The present invention relates to a safety chromogenic reagent, used as chromogenic agent ELISA immunoassay, has high sensitivity, good stability, and the use of safety.

【技术实现步骤摘要】
一种酶型时间温度指示体系
本专利技术涉及一种酶型时间温度指示体系，属于食品

技术介绍
食品在流通过程中经历了原材料采集、加工、物流、储藏、货架出售等阶段。在这些过程中，食品所处的温度、湿度等均可以对其品质造成影响。其中，对于易腐败食品，对其温度的监控尤其重要。这是因为，温度在食品流通过程中较难控制，如果温度高于设定温度一定时间，则容易造成易腐败食品变质，而传统食品包装上的有效期此时已经失去了其指示食品有效货架期的作用，不能对售卖者或消费者进行警示，从而容易引起食品安全问题，对消费者的生命安全造成隐患。为了严格、有效监控食品在流通过程中温度变化的过程，时间温度指示器(TTI)应运而生。其可以对食品所处外界环境中的温度给出连续性的响应，并且，此响应是不可逆的。时间温度指示器是智能包装的一种，它可以方便消费者准确识别食品的安全性，有效完成冷链温度的实时监控，避免食品出现不必要的浪费，提高食品在流通过程中各环节的可追溯性。目前，TTI的类型主要有扩散型、化学型、微生物型、电子型和酶型TTI等。其中，酶型TTI是指反应物(如脂类底物等)通过酶促反应产生的反应产物会导致指示剂发生颜色变化，从而在食品流通过程中可以监控时间温度变化历程的TTI。温度越高，反应速率越快，产生的颜色变化越明显。我国关于酶型TTI的研究较多，主要是因为它们的原理类似，采用不同的酶和底物就可以制备出一系列不同颜色变化的TTI。2009年，宁鹏[1]等人利用碱性脂肪酶与三乙酸甘油酯的水解反应，以酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为指示剂，通过反应体系颜色变化反映时间-温度的累积变化。田秋实等[2]研究了一种基于蛋白酶反应为基础的酶变型TTI，通过溶液pH的改变导致颜色发生明显变化，应用于监测淡水鱼糜制品在不同冷藏温度条件下的品质变化和货架期预测。2013年，郑光临[3]等人通过糖化酶对麦芽糊精的酶促反应，以碘液为指示剂，研发了一种适用于冷鲜肉等产品的TTI。2014年，冯钦[4]等人研究了淀粉酶型TTI及酶经固定化后的体系稳定性，确定了体系配方及最佳酶固定化条件。在实际应用中，上述酶型时间温度指示器会存在以下问题：(1)绝大多数酶型时间温度指示器都需要加入额外指示剂，一是以体系中酶催化反应导致pH值降低为基础，再加入pH指示器产生颜色变化，如2009年，宁鹏[1]等人利用碱性脂肪酶与三乙酸甘油酯的水解反应导致体系pH值降低，以酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为指示剂，通过反应体系颜色变化反映时间-温度的累积变化。2005年，浙江大学吴秋明[5]研制出一种脲酶型TTI，反应体系由磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、苯酚红指示剂及尿素底物组成。随着PH值的升高，该TTI能够呈现出从初始黄色到终点红色的变色过程。上述两种典型时间温度指示器体系都是加入了pH指示剂。另外一部分是以碘液为指示剂，根据底物与碘液产生颜色变化来指示，如2013年，郑光临[2]等人通过糖化酶对麦芽糊精的酶促反应，以碘液为指示剂，研发了一种适用于冷鲜肉等产品的TTI。他们的共同点均是加入指示剂导致体系更复杂，增加。且一些指示剂有毒性，不安全不适合运用在食品指示器中(2)由于均为单酶催化体系，反应的稳定性较差，体系颜色变化不明显；如2013年，葛蕾[6]基于酶促褐变原理的时间温度指示系统研究，以酪氨酸酶的酶促褐变为基础开发一种新型的时间温度指示系统。体系由无色变成褐色的过程可以指示时间温度的积累。由单酶催化底物产生颜色变化，体系简单，但是颜色变化不明显。如附图1整个过程颜色变化不明显。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种酶型时间温度指示器体系。本专利技术通过产生颜色变化，达到指示冷鲜食品经历的时间-温度的目的。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种酶型时间温度指示器体系，所述酶型时间温度指示器体系由两种酶和两种底物两部分组成；(1)所述的两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度分别为1～5μg/ml和0.05～0.2μg/ml，两种酶按照1:1～5:1的体积比加入体系中；(2)所述的两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，两种底物的浓度分别为0.1～0.4mg/ml以及0.05～0.2mg/ml，两种底物按照2:1～8:1的体积比加入体系中；(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖(GLU)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOX)；(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。在上述方案中优选的是，在所述两种酶和所述两种底物加入体系反应之前，所有配制出的溶液保存温度均低于其反应温度。在上述任一方案中优选的是，步骤(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度范围分别为3.5μg/ml和0.15μg/ml，两种酶按照2:1的体积比加入体系中。在上述任一方案中优选的是，步骤(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，两者加入的浓度分别为0.3mg/ml和0.15mg/ml，两种底物按照5:1的体积比加入体系中。在上述任一方案中优选的是，反应的温度为0～40℃。在上述任一方案中优选的是，反应的温度为0℃、4℃、20℃、30℃或40℃。在上述任一方案中优选的是，所有配制出的溶液保存0℃以下。在上述任一方案中优选的是，葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的体积关系是(1:1～5:1):(2:1～8:1)。本专利技术利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生葡萄糖酸和H2O2，然后在HRP的催化作用下，生成的H2O2氧化生成TMB生成一种有色的偶氮类化合物。从而产生颜色变化，达到指示冷鲜食品经历的时间-温度历史的目的。根据步骤(1)，确定了最佳酶浓度和双酶量的体积比，调整酶的浓度及两个酶的加入量后测体系吸光度，根据吸光度反映出酶活，进而控制反应的速度以及颜色变化快慢，优化可以呈现出一组最佳颜色的体系。根据步骤(2)，确定了最佳的底物浓度，调整底物的浓度可以控制反应的速度，同时随着底物量的增加，颜色越深越持久，所以可以通过底物量的调整，控制反应的速度和颜色的持久度。(参考实施例中的图4：由图可知，反应相同时间，在一定范围内，底物TMB浓度越大，颜色越持久)根据步骤(3)，先加入两个底物，然后加入氧化酶辣根过氧化物酶，最后再加入葡萄糖，因为在没有葡萄糖氧化酶的条件下，体系中不会产生H2O2,即也不会进行第二步反应，整个体系不反应，最后加入葡萄糖氧化酶后体系才开始反应，保证了实验得精确性和严谨性。现有技术常使用碱性脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等作为单一酶催化剂，碘液和pH指示剂作为颜色变化指示剂。与现有技术相比，本专利技术使用辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶共同作为酶催化剂，以有效指示时间温度变化历程。首先，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，被溶解氧氧化，生成葡萄糖酸和H2O2。随着反应的进行，生成的H2O2与另一底物TMB，在HRP的催化作用下，最终生成一种有色的偶氮类化合物，通过颜色变化程度，分析实验所处的温度变化历程。与现有技术相比，本专利技术的其中一种底物H2O2用量通过第一步反应控本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶型时间温度指示器体系，其特征在于：所述酶型时间温度指示器体系由两种酶和两种底物两部分组成；(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度分别为1～5μg/ml和0.05～0.2μg/ml，两种酶按照1:1～5:1的体积比加入体系中；(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺，两种底物的浓度分别为0.1～0.4mg/ml和0.05～0.2mg/ml，两种底物按照2:1～8:1的体积比加入体系中；(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖、3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。

【技术特征摘要】
1.一种酶型时间温度指示器体系，其特征在于：所述酶型时间温度指示器体系由两种酶和两种底物两部分组成；(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度分别为1～5μg/ml和0.05～0.2μg/ml，两种酶按照1:1～5:1的体积比加入体系中；(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，两种底物的浓度分别为0.1～0.4mg/ml和0.05～0.2mg/ml，两种底物按照2:1～8:1的体积比加入体系中；(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。2.根据权利要求1所述的酶型时间温度指示器体系，其特征在于：在所述两种酶和所述两种底物加入体系反应之前，所有配制出的溶液保存温度均低于其反应温度。3.根据权利要求1所述的酶型时间温度指示器体系，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，刘鹏，段敏，戴岳，刘文，郝佳，
申请(专利权)人：中国标准化研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11