抑制VEGF‑A受体相互作用的结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及抑制VEGF‑A受体相互作用的结合蛋白。本发明专利技术涉及对VEGF‑A特异的结合蛋白，尤其涉及包括结合结构域的重组结合蛋白，其抑制VEGF‑Axxx结合VEGFR‑2。这类结合蛋白的实例是包括具有所需结合特异性的锚蛋白重复结构域的蛋白。该结合蛋白可用于癌症和其他病理状况的治疗，例如眼病诸如年龄相关性黄斑变性。

Inhibition of A binding protein VEGF receptor interaction

The present invention relates to the inhibition of VEGF A binding protein receptor interaction. The present invention relates to VEGF A specific binding protein, especially including the binding domain of recombinant protein, the inhibition of VEGF Axxx combined with VEGFR 2. Examples of such binding proteins are proteins comprising a repeating protein domain having desired binding specificity. The binding protein can be used in the treatment of cancer and other pathological conditions, such as eye diseases such as age-related macular degeneration.

【技术实现步骤摘要】
抑制VEGF-A受体相互作用的结合蛋白本申请是国际申请日为2009年11月3日的国际申请PCT/EP2009/064483进入中国、申请号为200980153604.7的题为“抑制VEGF-A受体相互作用的结合蛋白”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及对VEGF-A特异的重组结合蛋白，以及编码这类VEGF-A结合蛋白的核酸，包括这类蛋白的药物组合物，和这类蛋白在治疗肿瘤和眼病中的用途。
技术介绍
血管生成(从先存在的血管生长出新的血管)，是数种病理状况下的关键过程，包括肿瘤生长和眼病，尤其是眼的新生血管形成疾病，诸如老年性黄斑变性(AMD)或糖尿病黄斑水肿(DME)(Carmeliet,P.,Nature438,932–936,2005)。血管内皮生长因子(VEGFs)刺激血管生成和淋巴管生成，通过激活内皮细胞中的VEGF受体(VEGFR)酪氨酸激酶(Ferrara,N.,Gerber,H.P.andLeCouter,J.,NatureMed.9,669–676,2003)。哺乳动物VEGF家族由称为VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D(亦称为FIGF)和胎盘生长因子(PlGF，亦称为PGF)的5种糖蛋白组成。VEGF-A已被证明是抗血管生成疗法的有效靶标(Ellis,L.M.andHicklin,D.J.,NatureRev.Cancer8,579-591,2008)。VEGF-A配体结合并活化3种结构类似的III型受体酪氨酸激酶，称为VEGFR-1(亦称为FLT1)，VEGFR-2(亦称为KDR)和VEGFR-3(亦称为FLT4)。VEGF配体对这些酪氨酸激酶受体中的每一种都具有独特的结合特异性，这有助于它们功能的多样性。响应配体结合，VEGFR酪氨酸激酶激活不同下游信号传导途径的网络。VEGFR-1和VEGFR-2主要发现于血管内皮，而VEGFR-3大部分发现于淋巴内皮。这些受体都具有胞外结构域，单跨膜区和被激酶插入结构域中断的共有酪氨酸激酶序列。最近，神经毡蛋白(NRP-1)(最初被鉴定为神经元指引介质的脑信号蛋白/脑衰蛋白家族的受体)，被证明作为VEGF-A的同种型特异性受体。各种同种型的VEGF-A已知由VEGF-A基因内8个外显子的选择性剪接产生。所有同种型包含外显子1-5和末端外显子，外显子8。外显子6和7(编码肝素-结合结构域)可以被包括或排除。这产生依据它们的氨基酸数目命名的蛋白家族：VEGF-A165，VEGF-A121，VEGF-A189等。但是，外显子8在核苷酸序列中包含两个3'剪接位点，这可以被细胞使用产生具有相同长度的两个家族的同种型，但C端氨基酸序列不同(Varey,A.H.R.etal.,BritishJ.Cancer98,1366-1379,2008)。利用外显子8中最接近序列(导致包括外显子8a)产生VEGF-Axxx(“xxx”表示成熟蛋白的氨基酸数目)(促血管生成家族的同种型)。最近描述的抗血管生成VEGF-Axxxb同种型是利用远端剪接位点(从邻近的剪接位点沿着基因66bp更远)产生。这导致剪接出外显子8a，以及产生编码VEGF-Axxxb家族的mRNA序列。VEGF-A165是主要的促血管生成同种型，通常在各种人实体瘤中过表达。VEGF-A165b是鉴定出的第一个外显子8b编码的同种型，显示具有抗血管生成作用(Vareyetal.,在上述引文中；Konopatskaya,O.etal.,MolecularVision12,626-632,2006)。它是VEGF-A的内源抑制形式，其降低VEGF-A诱导的内皮细胞增殖和迁移。尽管它可以结合VEGFR-2，VEGF-A165b结合不引起受体磷酸化或下游信号传导途径的活化。存在数种方法抑制VEGF-A信号传导，包括通过抗体中和配体或受体，以及利用酪氨酸激酶抑制剂阻断VEGF-A受体活化和信号传导。VEGF-A靶向疗法已被证明是AMD，DME，肾细胞癌和肝细胞癌中有效的单一治疗剂，而对转移性结肠直肠癌、非小细胞肺癌和转移性乳腺癌患者来说只有当其与化疗联用时才是有益的(Narayanan,R.etal.,NatRev.DrugDiscov.5,815-816,2005；EllisandHicklin,在上述引文中)。除了抗体，可以使用其他结合结构域来中和配体或受体(Skerra,A.,J.Mol.Recog.13,167-187,2000；Binz,H.K.,Amstutz,P.andPlückthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)。这类新型结合结构域基于设计的重复结构域(WO02/20565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand,C.,Forrer,P.,Grütter,M.G.,andPlückthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004)。WO02/20565描述了如何构建重复蛋白的大文库以及它们的一般应用。尽管如此，WO02/20565既没有公开具有对VEGF-Axxx的结合特异性的重复结构域的选择，也没有公开特异性结合VEGF-Axxx的重复结构域的具体重复序列基序。用现有疗法靶向VEGF-A不是在所有患者中都是有效的，或针对所有疾病有效的(例如，表达EGFR的癌症)。以下事实甚至变得日益清楚，与VEGF-A靶向疗法有关的治疗益处是复杂的，可能涉及多种机制(EllisandHicklin,在上述引文中)。例如，市售的抗VEGF药物，诸如bevacizumab(Avastin®)或ranibizumab(Lucentis®)(参见WO96/030046,WO98/045331和WO98/045332)或正在临床开发的药物，诸如VEGF-Trap®(WO00/075319)，不区分VEGF-A的促血管生成形式和抗血管生成形式，因此这两种形式都被它们抑制。因此它们抑制血管生成，并且剥夺健康组织的一种重要存活因子，即VEGF-Axxxb，产生细胞毒性和剂量限制性副作用，这进而限制功效。现有抗VEGF-A疗法的常见副作用是胃肠穿孔，出血，高血压，血栓栓子事件和蛋白尿(Kamba,T.andMcDonald,D.M.,Br.J.Cancer96,1788-95,2007)。因此，现在需要改进的抗血管生成剂来治疗癌症和其他病理状况。本专利技术的技术问题是鉴定新的抗血管生成剂，诸如具有对VEGF-Axxx的结合特异性的重复结构域，用于癌症和其他病理状况(例如眼病诸如AMD或DME)的改进治疗。通过提供权利要求所表征的实施方案来解决该技术问题。
技术实现思路
本专利技术涉及包括结合结构域的结合蛋白，其中所述结合结构域抑制VEGF-Axxx结合VEGFR-2，并且所述结合结构域在热解折叠时具有高于40℃的中点变性温度(Tm)，当在PBS中37℃温育1天时在高达10g/L的浓度形成少于5%(w/w)的不溶性聚集体。更具体地，本专利技术涉及包括至少一个重复结构域的重组结合蛋白，其中所述重复结构域以低于10-7M的Kd结合VEGF-Axxx，并抑制VEGF-Axxx结合VEGFR-本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域特异性结合VEGF‑A165，其中所述锚蛋白重复结构域包含两个或更多个连续重复组件，其中所述重复组件之一具有氨基酸序列ADSTGWTPLHLAVPWGHLEIVEVLLKYGADVNA（SEQ ID NO:29的氨基酸33‑65）。

【技术特征摘要】
2008.11.03 EP 08168166.01.包括至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域特异性结合VEGF-A165，其中所述锚蛋白重复结构域包含两个或更多个连续重复组件，其中所述重复组件之一具有氨基酸序列ADSTGWTPLHLAVPWGHLEIVEVLLKYGADVNA（SEQIDNO:29的氨基酸33-65）。2.权利要求1的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列ADSTGWTPLHLAVPWGHLEIVEVLLKYGADVNAKDFQGWTPLHLAAAIGHQEIVEVLLKNGADVNA（SEQIDNO:29的氨基酸33-98）。3.包括至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域特异性结合VEGF-A165，且其中所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列RDSTGWTPLHLAAPWGHPEIVEVLLKNGADVNAADFQGWTPLHLAAAVGHLEIVEVLLKYGADVNA（SEQIDNO:24的氨基酸33-98）。4.包括至少一个锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域特异性结合VEGF-A165，且其中所述锚蛋白重复结构域包含两个或更多个连续重复组件，其中所述重复组件之一由下述锚蛋白重复序列基序代表1D23G4TPLHLAA56GH7EIVEVLLK8GADVNA(SEQIDNO:5)其中1代表选自A,N,R,V,Y,E,H,I,K,L,Q,S和T的氨基酸残基；2代表选自S,A,N和R的氨基酸残基；3代表选自T,V和S的氨基酸残基；4代表选自W,F和H的氨基酸残基；5代表选自P和I的氨基酸残基；6代表选自W,F,I,L,T和V的氨基酸残基；7代表氨基酸残基P；和8代表选自A,H,N和Y的氨基酸残基。5.权利要求4的结合蛋白，其中在SEQIDNO:5的锚蛋白重复序列基序中1代表选自A和R的氨基酸残基；2代表选自S,A,N和R的氨基酸残基；3代表选自T,V和S的氨基酸残基；4代表选自W,F和H的氨基酸残基；5代表选自P和I的氨基酸残基；6代表选自W,F,I,L,T和V的氨基酸残基；7代表氨基酸残基P；和8代表选自A,H,N和Y的氨基酸残基。6.权利要求4的结合蛋白，其中所述由SEQIDNO:5的锚蛋白重复序列基序代表的重复组件具有氨基酸序列RDSTGWTPLHLAAPWGHPEIVEVLLKNGADVNA（SEQIDNO:24的氨基酸33-65）。7.权利要求4的结合蛋白，其中所述重复组件的另一个由锚蛋白重复序列基序1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVNA(SEQIDNO:1)代表，其中1、2、3、4、5、6和7相互独立地代表选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸残基。8.权利要求4的结合蛋白，其中所述重复组件的另一个由锚蛋白重复序列基序1D23G4TPLHLAA56GHLEIVEVLLK7GADVNA(SEQIDNO:6)代表，其中1代表选自A和R的氨基酸残基；2代表选自Y,F和H的氨基酸残基；3代表选自Q,F和T的氨基酸残基；4代表选自W和M的氨基酸残基；5代表选自T,A和M的氨基酸残基；6代表选自I,L和V的氨基酸残基；和7代表选...

【专利技术属性】
技术研发人员：HK宾茨，P福雷尔，MT施图姆普，
申请(专利权)人：分子组合公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH