通过质谱测定糖胺聚糖水平制造技术

检测糖胺聚糖(GAG)和/或测定一种或多种糖胺聚糖的水平可用于例如鉴定或监测各种医学病症、具有各种医学病症的患者的状态和/或对具有各种医学病症的患者的治疗的反应。本发明专利技术提供了通过利用例如质谱来检测糖胺聚糖和/或测定糖胺聚糖水平的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过质谱测定糖胺聚糖水平相关申请的交叉引用本申请要求2014年11月14日提交的美国临时专利申请No.62/080,154的优先权，其公开内容全部并入本文。
技术介绍
各种医学病症与糖胺聚糖的积累有关。糖胺聚糖(GAG)是参与许多生物过程的大型复合碳水化合物分子。糖胺聚糖包括衍生自氨基己糖的多糖，例如乙酰肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素及其共聚物。各种GAG根据例如其所含己糖胺、己糖或己糖醛酸单元的类型以及这些单元之间的糖苷键的几何构型而不同。在一些情况下，GAG分子可以分解成二糖组分。鉴于硫酸化、乙酰化、差向异构化及其他特征的程度，GAG和GAG衍生的二糖组分可以表现出大量的结构异质性。部分由于这样的变化，GAG涵盖广泛的不同分子，导致致使量化和表征方面的挑战的变化。某些GAG(例如，HS)不是单一化合物，而是在一些情况下具有不同分子量的相关分子的集合。这是造成这样的GAG(包括HS)的量化或表征不容易实现的一个原因。本领域需要用于测定GAG水平的额外和改进的方法。
技术实现思路
检测糖胺聚糖(GAG)和/或测定一种或多种糖胺聚糖的水平可用于例如鉴定或监测各种医学病症、具有各种医学病症的患者的状态和/或对具有各种医学病症的个体的治疗的反应。本专利技术提供了通过利用例如质谱检测糖胺聚糖和/或测定糖胺聚糖水平的方法。这样的方法、其用途、其应用的设备以及相关方法和组合物在本文中进一步描述。本文所述的方法至少在精确度、准确度、可重复性和通量方面相对于某些先前的方法有所改进。在一些特定情况下，本文所述的一种或多种方法至少在精确度方面相对于某些先前的方法有所改进。在其他情况下，本专利技术的某些实施方案的用途反而或者另外是其对于鉴定或监测各种医学病症、具有各种医学病症的患者的状态和/或对具有各种医学病症的个体的治疗的反应的适用性结果。为了规避GAG定量中的某些挑战，本专利技术的某些方法包括将一种或多种GAG分子裂解成二糖组分，随后对GAG裂解产物二糖进行定量，使得所测量的一种或多种GAG裂解产物二糖的水平为一种或多种GAG的直接定量提供替代或替选。在以单数(singular)提及二糖的某些情况下(例如，“二糖”或“单个二糖”)，术语“二糖”可以统称为存在于样品、群体等中的特定类型的所有分子，而不管是否指特定的二糖。如本公开所教导，许多GAG衍生的二糖(例如，GAG裂解产物)(包括某些异构二糖)可以通过反相(RP)色谱拆分，例如在用标记(例如疏水性标记，例如4-丁基苯胺(4-NBA))衍生化之后。在各种实施方案中，所述标记有助于在色谱期间分离单个分子或分子类型。可以包含用于一种或多种选择的二糖的同位素标记的内标(Istd)的可用性作为能够赋予高水平的准确度和可重复性的机制。在至少一个方面，本专利技术包括测定生物样品中糖胺聚糖(GAG)水平的方法，所述方法包括以下步骤：在使糖胺聚糖消化从而产生二糖混合物的条件下用一种或多种酶孵育生物样品；化学衍生化所述孵育步骤中产生的所述二糖混合物；测量每种单个衍生的二糖的量；和基于在测量步骤中测量的每种单个衍生的二糖的量来测定所述生物样品中的所述糖胺聚糖(GAG)水平。在这样的方法的某些实施方案中，所述糖胺聚糖包括硫酸乙酰肝素。在这样的方法的某些实施方案中，包括这样的实施方案，其中所述糖胺聚糖包括硫酸肝素酶，所述一种或多种酶包括一种或多种肝素酶，例如肝素酶I、II和/或III。在这样的方法的某些实施方案中，包括这样的实施方案，其中所述糖胺聚糖包括硫酸肝素酶，所述一种或多种酶包括选自软骨素酶AC、软骨素酶B、软骨素酶C、软骨素酶ABC和角质素酶的一种或多种酶。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，二糖混合物可包括二糖I-S(ΔUA，2S-GlcNS，6S)、II-S(ΔUA-GlcNS，6S)、III-S(ΔUA，2S-GlcNS)、IV-S(ΔUA-GlcNS)、II-A(ΔUA-GlcNAc，6S)和/或IV-A(ΔUA-GlcNAc)。在本专利技术的某些实施方案中，所述测量包括测量衍生的I-S(ΔUA，2S-GlcNS，6S)、衍生的II-S(ΔUA-GlcNS，6S)、衍生的III-S(ΔUA，2S-GlcNS)、衍生的IV-S(ΔUA-GlcNS)、衍生的II-A(ΔUA-GlcNAc，6S)和衍生的IV-A(ΔUA-GlcNAc)各自的量。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，可以用疏水部分衍生化所述二糖混合物。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，用4-丁基苯胺、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2氨基苯甲酸(邻氨基苯甲酸；2-AA)或2-氨基吖啶酮(AMAC)衍生化所述二糖混合物。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，所述测量步骤可包括首先通过色谱分离单个衍生的二糖；其次，通过质谱测量每种单个衍生的二糖。在一些特定实施方案中，所述色谱法是反相液相色谱法。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，其中与内标相比测量每种单个衍生的二糖的量。例如，在一些特定实施方案中，用4-丁基苯胺衍生化每种单个二糖，用13C6-4-丁基苯胺标记每种相应二糖的内标。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，基于所测量的每种单个二糖的量通过总计二糖浓度值来测定所述生物样品中的所述糖胺聚糖(GAG)水平。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，所述生物样品是脑脊液(CSF)样品。在一些特定实施方案中，所述CSF样品具有约10μl至100μl(例如，10μl至100μl、10μl至75μl、10μl至50μl、25μl至100μl、25μl至75μl或50μl至100μl)的体积。在一些特定实施方案中，所述CSF样品的体积范围为约45μl至55μl。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，所述生物样品是血液样品、血浆样品、尿液样品或血浆样品或尿液样品。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，首先对所述生物样品进行加工以提取糖胺聚糖。在本专利技术的各种方法中，例如以上所述的那些，所述生物样品含有浓度大于0.1μM(例如，大于0.1μM、大于0.5μM、大于1μM、大于5μM或大于10μM的糖胺聚糖衍生的二糖。在本专利技术的至少另一方面，本专利技术包括一种治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括：用包括以一定施用间隔向受试者施用治疗有效剂量的替代酶的治疗过程治疗患有溶酶体贮积病的受试者；通过前述权利要求中任一项所述的方法在所述治疗过程中测量从所述受试者获得的生物样品中的糖胺聚糖(GAG)水平；并且如果与治疗前的基线GAG水平相比糖胺聚糖水平降低10％，则维持治疗有效剂量和施用间隔。在一些相关实施方案中，如果糖胺聚糖水平降低例如1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％，则维持所述治疗有效剂量和所述施用间隔。在一些相关实施方案中，如果糖胺聚糖水平降低例如至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定生物样品中糖胺聚糖(GAG)水平的方法，所述方法包括以下步骤：a)在使糖胺聚糖消化从而产生二糖混合物的条件下用一种或多种酶孵育生物样品；b)化学衍生化步骤a)中产生的所述二糖混合物；c)测量每种单个衍生的二糖的量；d)基于在步骤c)测量的每种单个衍生的二糖的量来测定所述生物样品中的所述糖胺聚糖(GAG)水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.14 US 62/080,1541.一种测定生物样品中糖胺聚糖(GAG)水平的方法，所述方法包括以下步骤：a)在使糖胺聚糖消化从而产生二糖混合物的条件下用一种或多种酶孵育生物样品；b)化学衍生化步骤a)中产生的所述二糖混合物；c)测量每种单个衍生的二糖的量；d)基于在步骤c)测量的每种单个衍生的二糖的量来测定所述生物样品中的所述糖胺聚糖(GAG)水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖胺聚糖包括硫酸乙酰肝素。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种酶包括一种或多种肝素酶。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种肝素酶包括肝素酶I、II和/或III。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种酶包括一种或多种选自软骨素酶AC、软骨素酶B、软骨素酶C、软骨素酶ABC和角质素酶的酶。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述二糖混合物包括二糖I-S(ΔUA，2S-GlcNS，6S)、II-S(ΔUA-GlcNS，6S)、III-S(ΔUA，2S-GlcNS)、IV-S(ΔUA-GlcNS)、II-A(ΔUA-GlcNAc，6S)和/或IV-A(ΔUA-GlcNAc)。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述测量包括测量衍生的I-S(ΔUA，2S-GlcNS，6S)、衍生的II-S(ΔUA-GlcNS，6S)、衍生的III-S(ΔUA，2S-GlcNS)、衍生的IV-S(ΔUA-GlcNS)、衍生的II-A(ΔUA-GlcNAc，6S)和衍生的IV-A(ΔUA-GlcNAc)各自的量。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用疏水部分衍生化所述二糖混合物。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用4-丁基苯胺、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(邻氨基苯甲酸；2-AA)或2-氨基吖啶酮(AMAC)衍生化所述二糖混合物。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤c)包括：(i)通过色谱分离单个衍生的二糖：和(ii)通过质谱测量每种单个衍生的二糖。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述色谱是反相液相色谱12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与内标相比测量每种单个衍生的二糖的量。13.根据权利要求12所述的方法，其中用4-丁基苯胺衍生化每种单个二糖，用13C6-4-丁基苯胺标记每种相应二糖的内标。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于所测量的每种单个二糖的量的总计二糖浓度值来测定所述生物样品中的所述糖胺聚糖(GAG)水平。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品是脑脊液(CSF)样品。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述CSF样品的体积范围为约10μl至100μl。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述CSF样品的体积范围为约45μl至55μl。18.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血浆样品或尿液样品。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品首先被加工以提取糖胺聚糖。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品含有浓度大于0.1μM的糖胺聚糖。22.一种监测溶酶体贮积病治疗的方法，包括：用包括以一定施用间隔向受试者施用治疗有效剂量的替代酶的治疗...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·纳伊米，Y·邱，P·A·J·哈斯利特，A·巴比尔，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US