天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法技术

本发明专利技术涉及一种天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法，即，每细胞提呈肽拷贝数的测定。本发明专利技术不仅可用于开发抗体疗法或肽疫苗，而且对分子免疫监测有很高的价值，对识别免疫治疗策略中新肽抗原的过程有用，如，各个疫苗、基于抗体的疗法或癌症中过继T细胞转移方法、感染性和/或自身免疫性疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法本专利技术涉及一种天然加工的HLA限制性癌肽绝对定量方法，即，每细胞提呈肽拷贝数的测定。本专利技术不仅可用于开发抗体疗法或肽疫苗，而且对分子免疫监测有很高的价值，对识别免疫治疗策略中新肽抗原的过程有用，如，各个疫苗、基于抗体的疗法或癌症、感染性和/或自身免疫性疾病中过继T细胞转移方法。专利
深入了解人类白细胞抗原(HLA)结合肽在原发疾病组织中的表达水平可大大改进开发癌症免疫疗法以及自身免疫和感染疾病的免疫治疗，从而诱发免疫系统T细胞对抗癌症。该信息与基于抗体疗法或肽疫苗相关，特别地，与基于蛋白质、DNA或RNA等分子实体的任何其他类型的T细胞疫苗相关。对于患者来源组织，之前没有每个细胞规模绝对拷贝的这种量化数据。EP1508047B1中披露了上述避免“反向免疫学”相关问题的肽的一种识别方法。如上所述，该方法不能用于所述肽的定量分析。WO2005/076009中披露了运用标记策略的另一种方法，其中允进行一些定量分析，但不能在绝对的规模上进行。例如，WO03/025576中披露了其他标记方法，Martin等人在《蛋白质组学》(Proteomics2003，3，2208-2220)一文中也进行了披露。Fortier等人披露了另一种方法(TheMHCclassIpeptiderepertoireismoldedbythetranscriptome，JEM，Vol.205，No.3，March17，2008595-610)。该方法的缺点是：由于酸洗脱，需要从非MHC结合肽中剥离出MHC结合肽。这使用b2m-敲除细胞株实施。因此，该方法不能用于原发患者肿瘤材料。在该方法中，原发鼠胸腺细胞与鼠EL4细胞株进行了对比。起始量透过测量MHC-I分子进行了调整。仅此一项大大限制了Fortier等人披露的方法。另外，没有应用不同尺寸和来源的原发组织所需要的正态化。相反，使用均衡的起始原料，让正态化过时。然而，对于主要(患者)材料正态化是绝对必要的。WO2011/128448披露了从大规模原生组织标本中定量识别相关HLA-结合肽抗原而无需标记的一种方法。该方法包括提供至少一个患病初生组织样本和至少一个初生健康组织样本的步骤，初生健康组织优选对应于患病组织，从所述样本中分离MHC肽配体，对所述MHC配体肽执行HPLC-MS分析，提取每个信号的前体离子信号强度(面积)(如来自于分析)，确定所述MHC配体肽的序列，和使其他步骤以及数据质量控制步骤正常化，以便相对量化所述MHC肽配体而无须标记。Hassan等人(在：HassanC，etal，AccuratequantitationofMHC-boundpeptidesbyapplicationofisotopicallylabeledpeptideMHCcomplexes，JProt(2014)，http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.07.009)中披露一种方法，在这种方法中，在细胞裂解后(即，正常样本加工之前)制备和直接加入同位素标记肽MHC单体(hpMHC)。使用这种方法，样本加工期间所有的损失均可计入，并且可对特定的MHCI类提呈配体进行准确测定。该研究查明了免疫纯化步骤是样本预处理期间极端损失的原因，并为这些损失提供了解决方案。提出的策略可用于获得表位拷贝数的可靠视图，因此，可改进疫苗设计和免疫治疗策略。能否刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现存在肿瘤相关以及疾病抗原增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的各种机制。细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。尤其是识别与主要组织兼容性复合体(MHC)I类分子结合的肽的CD8阳性T细胞(T-CD8+)。通常8至12个氨基酸残基的这些肽源自蛋白质或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)，在这种反应中发挥重要作用。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。MHC分子有两类：大部分有细胞核的细胞上都可发现的MHC-I类分子。MHC分子分别由一条α重链和β-2-微球蛋白(MHC-I类受体)或一条α和一条β链(MHC-II类受体)组成。其三维构造形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。MHC-I类分子提呈主要为内源性的蛋白、DRIPS和较大肽裂解生成的肽。MHCII类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，并且主要提呈在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHCI类分子的复合体由负载相应TCR(T细胞受体)的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞进行识别，而肽和MHCII类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因此，TCR、肽和MHC按照1∶1∶1的化学计量呈现，这一点已是共识。对于触发(引发)细胞免疫反应的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(″锚″)。这样，每个MHC等位基因都有一个″结合基序″，可控制肽与结合沟槽特异性结合的能力。在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们还必须能被T细胞特异性T细胞受体(TCR)识别。肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应的肿瘤细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。目前将肿瘤相关抗原或疾病相关抗原分类为以下主要几组：癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA[肿瘤相关抗原；疾病相关抗原缩写为DAA]属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLAI类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员或NY-ESO-1。分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA，大多数TAA发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛地用于癌症的免疫治疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。过量表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过量表达能够透过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等本文档来自技高网...

【技术保护点】
细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量方法，所述方法包括a)制备提呈来自包含细胞的生物样本的所述至少一种MHC肽配体的细胞，b)测定步骤a)所述制备的细胞数，c)添加已知量待量化的所述至少一种肽‑MHC配体和/或肽‑MHC配体复合物至步骤a)所述制备品(″加样I″)，d)分离来自步骤c)所述制备品的至少一种MHC肽配体，以获得肽洗脱物，e)添加已知量待量化的所述至少一种MHC肽配体至所述肽洗脱物(″加样II″)，f)对所述至少一种MHC肽配体进行质谱分析，以产生至少一个aa)用于步骤d)中分离效率的信号，bb)步骤e)中添加的已知量的所述至少一种MHC肽配体的信号，以及cc)来自步骤a)所述制备细胞的所述至少一种MHC肽配体的信号，和；g)定量基于步骤f)中获得的信号与以下步骤中获得的信号比较的所述至少一种MHC肽配体aa)获得的细胞计数，bb)步骤c)中添加的待量化的已知量所述至少一种肽‑MHC配体和/或肽‑MHC配体复合物，和cc)步骤e)中添加的待量化的已知量所述至少一种MHC肽配体，其中，实现了细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.30 GB 1423361.3;2014.12.30 US 62/097,9941.细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量方法，所述方法包括a)制备提呈来自包含细胞的生物样本的所述至少一种MHC肽配体的细胞，b)测定步骤a)所述制备的细胞数，c)添加已知量待量化的所述至少一种肽-MHC配体和/或肽-MHC配体复合物至步骤a)所述制备品(″加样I″)，d)分离来自步骤c)所述制备品的至少一种MHC肽配体，以获得肽洗脱物，e)添加已知量待量化的所述至少一种MHC肽配体至所述肽洗脱物(″加样II″)，f)对所述至少一种MHC肽配体进行质谱分析，以产生至少一个aa)用于步骤d)中分离效率的信号，bb)步骤e)中添加的已知量的所述至少一种MHC肽配体的信号，以及cc)来自步骤a)所述制备细胞的所述至少一种MHC肽配体的信号，和；g)定量基于步骤f)中获得的信号与以下步骤中获得的信号比较的所述至少一种MHC肽配体aa)获得的细胞计数，bb)步骤c)中添加的待量化的已知量所述至少一种肽-MHC配体和/或肽-MHC配体复合物，和cc)步骤e)中添加的待量化的已知量所述至少一种MHC肽配体，其中，实现了细胞上至少一种MHC肽配体的绝对定量。2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述至少一种MHC肽配体选自一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：托尼·温斯切尼克，朱莉娅·莱博尔德，
申请(专利权)人：伊玛提克斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE