鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺制造技术

本发明专利技术公开了鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺，属于生物制药中抗体治疗剂领域。本发明专利技术以β‑丙内酯做为灭活剂，联合使用

The inactivation process of duck Tembusu virus antibody in yolk virus

The present invention discloses inactivated virus of duck Tembusu virus technology yolk antibodies, antibody belongs to biological pharmaceutical treatment field. The invention uses beta propiolactone as inactivating agent, combined use

【技术实现步骤摘要】
鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺
本专利技术属于生物制药中抗体治疗剂领域，具体涉及鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺。
技术介绍
鸡卵黄抗体(EggYolkIm-munoglobulin)是存在于卵黄中的免疫球蛋白，它是由母鸡血清中的免疫球蛋白转移而来。卵黄抗体可以应用于临床疾病的治疗，如鸡传染性法氏囊病、新城疫、鸭瘟、小鹅瘟、猪瘟等等。在临床实践中，卵黄抗体的预防和治疗效果非常理想，同时卵黄抗体的制造工艺简单价廉，几年前在养禽业生产中用量很大，发挥过十分重要的作用。但是，没有经过病原微生物灭活的抗体类治疗剂存在十分明显的问题。其原因在于制备抗体采用的禽极易携带垂直传播性病原，如大肠杆菌、沙门氏菌、减蛋综合征病毒、禽流感病毒等；另外，由于一些企业生产条件简单，生产过程中容易混杂入一些外源性病毒。鉴于这些情况，脱脂卵黄抗体必须进行禽源、外源性病原微生物的灭活处理，防止使用卵黄抗体后造成传播病原的扩散甚至疾病的爆发。β-丙内酯(BPL)是一种杂环化合物，对病毒具有很强的灭活作用，比福尔马林作用强25倍，但对病毒抗原影响或破坏作用较小。其作用机制通过与嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应改变病毒核酸结构达到灭活病毒的目的，蛋白不发生反应，不影响抗体的效价。β-丙内酯虽是一种致癌物，但极易水解，37℃2小时可以完全水解，水解后形成人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，对人体无害，在国外已广泛用于各种疫苗的灭活。将BPL用于卵黄抗体外源型病毒灭活，具有安全的和不影响抗体效价等优点。但是灭活剂β-丙内酯成本较高，在国内的实际生产中应用较少，多数使用甲醛灭活。有研究报道，BPL的浓度和反应时间与灭活效果存在一定关系。所以优选出BPL的最佳灭活条件，在合理节约的条件下，获得良好的灭活效果是关键。此外，由于兽用高免卵黄液价格低廉和针对地方变异病原株的特殊性要求，在我国现有条件下，绝大多数生产厂家只能使用非SPF蛋。所以除了病毒以外，高免卵黄液中还容易携带垂直传播性的细菌性病原，比如沙门氏菌、大肠杆菌等。此外，在制备的过程中也可能带来一些细菌的污染。60Coγ射线具有较强的穿透力，在生物体中能均匀地产生作用，主要是通过作用于病毒核酸(DNA、RNA)而造成病毒失活，可以完全杀灭高免卵黄液中的大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体，且不影响卵黄抗体的效价和理想性质。60Coγ射线对微生物有较强的杀灭作用，不同类型的病毒对60Coγ射线的敏感性是有较大差别的。控制辐射的剂量和剂量率，在灭活微生物的同时不影响卵黄抗体的效价和理化性质是关键。本专利技术采用BPL联合使用60Coγ射线灭活鸭坦布苏病毒中的外源病毒，来获得更安全、有效、稳定的产品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺。本专利技术所采取的技术方案是：鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺，是利用β-丙内酯加入到脱脂卵黄抗体中，混合作用，再以60Coγ射线进行照射，灭活卵黄中的病毒。优选的，脱脂卵黄抗体的制备方法为：按照卵黄与酸化水为1：(4-8)的体积比加入酸化水并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置4-6小时，酸化完成后，加入终浓度为0.2％正辛酸，搅拌并在室温放置3-5小时，分离上清液，取上清液即为脱脂卵黄抗体。优选的，脱脂卵黄抗体的制备方法为：按照卵黄与酸化水为1：6的体积比加入酸化水并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置5小时，酸化完成后，加入终浓度为0.2％正辛酸，搅拌并在室温放置3-5小时，分离上清液，取上清液即为脱脂卵黄抗体。优选的，.酸化水为纯化水利用盐酸调节pH为4.0-5.0得到的。优选的，酸化水为纯化水利用盐酸调节pH为4.5得到的。优选的，加入终浓度为0.02％-0.06％的β-丙内酯，与脱脂卵黄抗体混合后，在4℃反应24-36小时。优选的，利用37℃反应2小时终止β-丙内酯的灭活后，再以60Coγ射线进行照射。优选的，60Coγ射线所用的剂量为2.5-6.5kGy，剂量率为12-15Gy/min。在辐射损伤的整个发展过程中，吸收剂量相同时，吸收剂量率高，所需照射时间就短，在单位时间内病毒或细菌的核酸分子被破坏的几率增高，且在较短时间内又不利于病毒或细菌本身修复，因此灭活效果好。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用β-丙内酯联合使用60Coγ射线灭活鸭坦布苏病毒中的外源病毒，来获得更安全、有效、稳定的产品。其中β-丙内酯的使用量最低只需0.02％即可，加上剂量为3.0kGy的60Coγ射线，经过充分的灭活反应，所获得的产品经过盲传三代，仍然安全可靠。本专利技术方法安全，因为β-丙内酯极易水解，水解后形成人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，对人体无害；60Coγ射线不会残留，经过60Coγ射线照射后的抗体稳定无菌。本专利技术方法简单、易于操作：操作相对比较简便，没有复杂的程序。本专利技术的灭活方法不影响效价：β-丙内酯、60Coγ射线灭活都不直接作用于病毒蛋白，不影响抗体效价，对抗体的治疗效果没影响。具体实施方式l、材料1.1灭活剂β-丙内酯：(β-propionolactone，BPL)，深圳迈瑞尔化学技术有限公司进口分装，CAS号69-65-7。1.2钴源华南农业大学生物技术开发公司。1.3正辛酸，广东中鹏化工有限公司，批号：520168。1.4指示病毒：鸭坦布苏病毒0.25ml。剂型：冻干毒。广东农科院。1.5SPF鸡胚：10日龄鸡胚购自广东永顺生物制药有限公司。2、方法1)脱脂卵黄的制备：采集鸭坦布苏灭活疫苗免疫后高免蛋，经检验消毒后，采取手工或机械方式分离蛋清和卵黄。将鸡蛋用清水洗去污物，再放入含0.5％新洁尔灭溶液浸泡20min，然后晾干。用75％酒精棉擦拭蛋壳，无菌操作打开蛋壳，将蛋清和蛋黄分开，把蛋黄放于灭菌烧杯中，按照卵黄与酸化水1：6体积加入酸化水(用1mol/L盐酸调pH值至4.5)并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置5小时，酸化完成后，加入适量正辛酸溶液，所添加的辛酸终浓度为体积百分比m，其中0<m≤1％；搅拌并在室温(15-25℃)放置3-5小时，分离上清液，取上清液即为脱脂卵黄抗体。2)β-丙内酯灭活：将β-丙内酯加入上述制备的脱脂卵黄抗体，β-丙内酯添加的终浓度为0.01％-0.06％。震荡30min，置4℃，作用20-36小时，然后在37℃水浴中水解2h。3)60Coγ射线照射将第2)步所得卵黄抗体60Coγ射线进行照射灭活病毒和杀灭细菌，60Coγ射线所用的剂量为2.5-6.5kGy，剂量率为12-15Gy/min。4)灭活结果的检验。下面利用实施例进一步阐述本专利技术，但不限于此。β-丙内酯灭活鸭坦布苏病毒试验中：在卵黄抗体中加入指示病毒ND，使病毒终浓度为106EID50/0.1ml。随后分为三组，每组300ml，加入适量的β-丙内酯，边加边摇，使其充分混合。根据所加入β-丙内酯终浓度不同分别得到实施例1-6。然后将胚液倒于另一灭菌容器中。置4℃下进行灭活反应20-36小时，每小时振摇1次。于20小时、24小时、30小时、36小时分别取样，于37℃水浴中水解2h。实施例1-6的β-丙内酯终浓度分别为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％。进一步以60Coγ射线进行照射，60Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺，其特征在于：利用β‑丙内酯加入到脱脂卵黄抗体中，混合作用，再以

【技术特征摘要】
1.鸭坦布苏病毒卵黄抗体中病毒的灭活工艺，其特征在于：利用β-丙内酯加入到脱脂卵黄抗体中，混合作用，再以60Coγ射线进行照射，灭活卵黄中的病毒。2.根据权利要求1所述的灭活工艺，其特征在于：脱脂卵黄抗体的制备方法为：按照卵黄与酸化水为1：（4-8）的体积比加入酸化水并降温至2-8℃，搅拌均匀，2-8℃静置4-6小时，酸化完成后，加入适量正辛酸溶液，搅拌并在室温放置3-5小时，分离上清液，取上清液即...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏平华，王小庆，
申请(专利权)人：广州格雷特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44