用于HPV‑CTL细胞的体外培养试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及体外培养试剂盒，具体的说是一种用于HPV‑CTL(Human papillomavirus‑CTL)细胞的体外培养试剂盒。试剂盒内容物中包括：诱导CTL细胞分化的包被瓶；诱导T细胞分化的包被瓶；刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子；和，使T细胞携带相关抗原刺激HPV‑CTL细胞增殖、成熟的细胞因子。本发明专利技术将HPV‑CTL细胞体外培养所需要的复杂试剂和耗材规范的组合在一起，全部操作规范化、模式化，不仅提高了工作效率，而且降低了人员间操作带来的细胞质量和产量差异。

A kit for HPV cultured CTL cells in vitro

The present invention relates to a kit in vitro, specifically for HPV CTL (Human papillomavirus CTL) kit for cell culture in vitro. Including the kit contents: CTL cell differentiation induced by coated bottle; T cell differentiation induced by stimulation of CTL coated bottles; and T cell proliferation; and, T cells carrying antigen to stimulate the proliferation of CTL cells, HPV mature. The present invention will need complex reagents and consumables specification together HPV cultured CTL cells in vitro, all operating norms and patterns, not only improve the work efficiency, but also reduce the cell quality and yield differences between personnel operation bring.

【技术实现步骤摘要】
用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒
本专利技术涉及体外培养试剂盒，具体的说是一种用于HPV-CTL(Humanpapillomavirus-CTL)细胞的体外培养试剂盒。
技术介绍
世界范围内宫颈癌是妇女第二常见癌症。每年新发病例约50万，80％发生在发展中国家，死亡率高达50％。我国每年新发病例13.15万，占世界总发病人数1/3，每年约5万人死于宫颈癌。WHO于1992年宣布人乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是引起宫颈癌的首要原因。人类乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，就女性而言，HPV的终身感染率累积可高达60％～70％。1995年，国际癌症研究署(IARC)专题讨论会将HPV感染确定为宫颈癌的主要病因，明确子宫颈癌是一种感染性疾病。HPV感染是宫颈癌的必要因素，反复或持续的HPV感染可能会导致细胞向恶性表型的转化。HPV16、18亚型对宫颈移行带具高度的亲和力，与宫颈癌的关系最为密切，称为高危型HPV。高危型HPV感染是引起宫颈癌和宫颈内上皮瘤变(CIN)的主要因素。早期宫颈癌放疗或手术的效果好，而晚期则失去手术机会，主要以放疗为主。杜绝及根除HPV就可以预防、治愈宫颈癌,因此有必要寻找一些新的治疗手段。以肿瘤的免疫治疗为主的肿瘤生物治疗是目前临床治疗恶性肿瘤继手术、放疗、化疗之后的第4种模式，它既可以独立地治疗肿瘤，又可与手术及放、化疗结合，具有疗效高、特异性强、副作用小等优点，尤其对于中晚期已经发生转移的恶性肿瘤而言，它具有独到的治疗作用，近年来越来越受到人们的关注。但临床资料表明多种肿瘤细胞可以有效逃避机体的免疫作用，因此肿瘤特异性抗原的免疫治疗是抗病毒及抗肿瘤的研究热点。基于肿瘤特异性抗原的免疫治疗可以启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应为主的抗肿瘤效应，有效打击肿瘤，防止转移复发且不伤及无关组织。因其抗肿瘤特异性和免疫记忆性是其它方法所不能比拟的，故在肿瘤综合治疗中显示出很好的应用前景。随着对免疫应答机制的深入研究，人们已经意识到启动免疫应答程序的并不是整个抗原分子，而是与MHC分子结合的氨基酸短肽，即CTL表位，因此寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的关键。细胞毒T淋巴细胞(CTL)是目前研究较多的免疫活性细胞，用表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原的CTL表位肽刺激机体，可以产生抗原特异性的CTL细胞，从而参与肿瘤免疫应答，其机理在于用CTL表位肽刺激机体后，可引起抗原特异性的CTL细胞的克隆增殖，而CD8+的CTL是目前认为抗肿瘤免疫的主要效应细胞，其向胞外释放穿孔素、细胞溶解素等物质或通过细胞表面的死亡受体(肿瘤坏死因子受体家族的成员，包括FAS)等溶解(即杀灭)靶细胞，同时亦可分泌IFN-γ等细胞因子间接杀伤肿瘤细胞，为杀伤肿瘤创造一个良好的微环境。体内的初始T淋巴细胞，经过肿瘤抗原刺激后可分化为效应性T细胞即CTL细胞，杀伤肿瘤，其中一部分效应T淋巴细胞可分化为效应型记忆T淋巴细胞，这种记忆性T淋巴细胞对肿瘤相关性抗原再次刺激后可表现出强烈有效的免疫应答，从而发挥杀伤功效，这也是临床应用CTL抗原肽杀伤肿瘤的一个理论基础。因此应用基于肿瘤抗原的CTL表位肽直接诱导特异性CTL抗肿瘤应答，已经成为一种方便有效的方法。综上所述，用基于肿瘤抗原的CTL表位肽直接诱导抗原特异性CTL的方法，是十分有效的。急需寻找HPV相应的CTL表位肽，建立高效的HPV-CTL细胞体外培养方法，同时也更有必要设计与之相符的规范的试剂盒来保证培养方法的及时、准确、顺利进行。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种将人的外周血样品中的单个核细胞诱导为HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒，该试剂盒可以用于HPV-CTL细胞体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒，试剂盒内容物中包括：诱导CTL细胞分化的包被瓶；诱导T细胞分化的包被瓶；刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子；和，使T细胞携带相关抗原刺激HPV-CTL细胞增殖、成熟的细胞因子。所述试剂盒内容物包括无血清培养基、细胞分选液和细胞分散剂，其中，细胞分散剂为10％的人血清白蛋白。所述诱导CTL细胞分化的包被瓶(CTL3)为经HPV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15包被的包被瓶；所述诱导T细胞分化的包被瓶(CTL4)为经抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21包被的包被瓶。所述诱导CTL细胞分化的包被瓶(CTL3)为将HPV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15充分溶解于磷酸盐缓冲液内得包被溶液，将所得包被溶液浸润整个培养瓶的底面，浸润后于4℃静置12-24小时，而后将经包被的培养瓶于冻干机器中启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将初始CTL3包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到＜1000Pa，抽干开始；自动运行5小时后，打开CO2进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO2进气阀，取出CTL3细胞包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用；其中，包被溶液中HPV抗原肽浓度为200-220ng/mL、CD137单克隆抗体浓度为100-110ng/mL、γ干扰素浓度为0.18-0.2万单位/mL、白细胞介素15浓度为30-35ng/mL；所述诱导T细胞分化的包被瓶(CTL4)为将抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21充分溶解于磷酸盐缓冲液内得包被溶液，将所得包被溶液浸润整个培养瓶的底面，浸润后于4℃静置12-24小时，而后将经包被的培养瓶于冻干机器中启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将初始CTL4包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到＜1000Pa，抽干开始；自动运行5小时后，打开CO2进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO2进气阀，取出CTL4细胞包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用。其中，包被溶液中终抗CD3单克隆抗体浓度为150-165ng/mL、植物凝集素浓度为50-55μg/mL、白细胞介素21浓度为80-90ng/mL。所述刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子为刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子5、细胞因子6和细胞因子8，其中，细胞因子5的成分为100万单位的IL-2，所述细胞因子6的成分为100万单位的IL-2，细胞因子8的成分为400万单位的IL-2；使T细胞携带相关抗原刺激HPV-CTL细胞增殖、成熟的细胞因子为使T细胞携带相关抗原刺激HPV-CTL细胞增殖、成熟的细胞因子7，其中，细胞因子7的成分为160ng的HPV抗原肽。所述细胞因子5的使用浓度为0.7万单位/mL，细胞因子6的使用浓度为0.3万单位/mL，细胞因子7的使用浓度为8ng/mL，细胞因子8的使用浓度为0.26万单位/mL。一种利用所述用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒进行体外培养的方法，将待培养细胞于所述试剂盒内细胞分选液内对T淋巴细胞进行定向分选：而后对CTL细胞及T淋巴细胞进行诱导、分化、培养；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于HPV‑CTL细胞的体外培养试剂盒，其特征在于：试剂盒内容物中包括：诱导CTL细胞分化的包被瓶；诱导T细胞分化的包被瓶；刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子；和，使T细胞携带相关抗原刺激HPV‑CTL细胞增殖、成熟的细胞因子。

【技术特征摘要】
1.一种用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒，其特征在于：试剂盒内容物中包括：诱导CTL细胞分化的包被瓶；诱导T细胞分化的包被瓶；刺激CTL、T细胞分裂增殖的细胞因子；和，使T细胞携带相关抗原刺激HPV-CTL细胞增殖、成熟的细胞因子。2.按权利要求1所述的用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒，其特征在于：试剂盒内容物包括无血清培养基、细胞分选液和细胞分散剂，其中，细胞分散剂为10％的人血清白蛋白。3.按权利要求1所述的用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒，其特征在于：所述诱导CTL细胞分化的包被瓶(CTL3)为经HPV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15包被的包被瓶；所述诱导T细胞分化的包被瓶(CTL4)为经抗CD3单克隆抗体、植物凝集素、白细胞介素21包被的包被瓶。4.按权利要求1或3所述的用于HPV-CTL细胞的体外培养试剂盒，其特征在于：所述诱导CTL细胞分化的包被瓶(CTL3)为将HPV抗原肽、CD137单克隆抗体、γ干扰素、白细胞介素15充分溶解于磷酸盐缓冲液内得包被溶液，将所得包被溶液浸润整个培养瓶的底面，浸润后于4℃静置12-24小时，而后将经包被的培养瓶于冻干机器中处理，待用；其中，包被溶液中HPV抗原肽浓度为200-220ng/mL、CD137单克隆抗体浓度为100-110ng/mL、γ干扰素浓度为0.18-0.2万单位/mL、白细胞介素15浓度为30-35ng/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢威，李佳，
申请(专利权)人：广州可伴咨询中心普通合伙，
类型：发明
国别省市：广东,44