一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：准备藕皮、食用部位和藕节三个供试部位并分别粉碎；将粉碎的三个供试部位分别进行多糖提取处理，得到多糖样品；对多糖样品分别进行检测，得到HPSEC‑UV‑RI二元图谱；多次重复得到多个不同品种莲藕的三个供试部位多糖的HPSEC‑UV‑RI二元图谱，进一步以平均向量构建得多糖HPSEC‑UV‑RI二元标准指纹图谱。优点在于，不同品种及不同部位莲藕多糖的HPSEC‑RI指纹特征具有明显差异，能用于鉴别莲藕品种；HPSEC‑UV指纹图谱可作为HPSEC‑RI指纹图谱的补充，以更准确的对莲藕品种进行鉴别。

Method for constructing HPSEC fingerprint of lotus root polysaccharide

The invention relates to a construction method of lotus root polysaccharide HPSEC fingerprint, which comprises the following steps: preparing lotus root bark, edible parts and joints of three tested parts were crushed; crushed three tested part of polysaccharide extraction, obtained polysaccharide samples; the polysaccharide samples were detected HPSEC UV RI, get two yuan of; repeatedly get many different varieties of lotus three tested parts of polysaccharide HPSEC UV RI two yuan on average vector map, further constructing the polysaccharide HPSEC UV RI two yuan standard fingerprint. Has the advantages of different varieties and different parts of lotus root polysaccharide HPSEC RI fingerprint characteristics have obvious differences, can be used for identification of Lotus Varieties; HPSEC UV fingerprint can be used as HPSEC RI fingerprint, more accurate identification of lotus varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法
本专利技术属于农产品及其功能成分的指纹图谱分析领域，具体涉及一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法。
技术介绍
莲藕是我国栽培最广、销售量和销售范围最大的水生蔬菜。据中药大辞典所述，莲藕生用可清热、凉血、散疲、治热病烦渴，熟用可健脾、开胃、益血、生肌、止泻。上述功效可能部分与多糖有关，莲藕多糖经研究证实具有抗疲劳(周桃英，2011)、降血糖(罗登宏，2011)、抗氧化(罗登宏，2011；严浪，2008；Jiang,2011)和免疫调节(Jiang,2011)等活性。新鲜莲藕中多糖提取得率可达5％(孙杰，2016；王瑜，2007)，且藕皮、藕节和藕渣等传统加工副产物中也含有丰富的多糖(李正一，2016；严浪，2007)。目前，莲藕加工科技水平薄弱，产品“同质化”现象严重，经济附加值不高，且加工过程中产生大量的藕皮、藕节和藕渣等副产物均未得到有效开发利用。相应地，莲藕多糖的高值开发利用有助于完善产品结构和拓展产业链，在功能食品和生物医药领域应用前景良好，而多糖的质量控制极为关键。莲藕种质资源极为丰富，在“国家种质武汉水生蔬菜资源圃”中保存资源已达310份，而人工选育品种达12种(柯卫东，2015)。韩延闯(2004)、刘月光(2006)、全志武(2008)和李长春(2011)均采用分子生物学技术研究了莲藕种质资源的遗传多态性，并构建生物指纹图谱用于品种鉴别，但相关技术因无法直接用于藕原料的分析鉴别而与实际生产脱节，亦无法反应莲藕中的生物活性成分信息。基于物质群体的认识，指纹图谱可实现资源真实性鉴别、质量一致性评价和产品稳定性分析(李强，2013)。多糖的组成与结构极为复杂，导致一般的理化分析和结构鉴定很难辨识多糖的质量优劣，但却为多糖的识别提供了丰富的指纹信息。多糖的指纹图谱技术在多糖及其原料质量控制方面有广泛的应用。枸杞多糖(高向东，2014)、猴头菇多糖(周春晖，2016)、铁皮石斛多糖(罗建平，2009)、决明子多糖(高新开，2014)、芦荟多糖(董银卯，2015)的指纹图谱技术不仅可以突破多糖品质与真伪鉴别，还可以实现原料品种及产地的区别。然而，莲藕多糖的指纹图谱技术尚未见报道。莲藕中多糖具有良好的开发价值，急需研发可靠的质量评价技术。原料质量控制是多糖品质的重要保障，莲藕的种质资源丰富，现有的品种鉴别技术尚无法直接应用于藕精深加工产品质量控制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其可用于莲藕品种的鉴别。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：1)取莲藕洗净后切分为藕段和藕节，藕段刨取皮部，藕节切除须根，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位，分别粉碎至5～20目待用；2)将步骤1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别进行多糖提取处理，分别得到相应的三份莲藕多糖样品；3)以步骤2)得到的三份莲藕多糖样品为测试对象，采用HPSEC检测多糖样品的分子量分布，检测时将UV检测器和RI检测器串联使用，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位相应的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱；4)多次重复步骤1)、2)和3)分别得到多个不同品种莲藕的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱(HPSEC-UV-RI二元图谱)，以所有多糖HPSEC-UV指纹图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-UV标准指纹图谱，以所有多糖HPSEC-RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-RI标准指纹图谱，则完成莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以有如下进一步的具体选择。具体的，步骤2)中的多糖提取处理的具体内容为：将供试部位按料液比1g:15mL加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至pH4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至还原糖含量不再增加，升温至95℃并保持10min灭酶；酶解提取液在70℃下真空浓缩至原体积1/4，采用Sevage法脱蛋白后加入无水乙醇至80％乙醇体积浓度，于4℃静置过夜；采用4500r/min离心10min分离沉淀多糖；多糖经80％乙醇洗涤后挥发乙醇，以少量水复溶后冷冻干燥得到莲藕多糖样品。具体的，步骤3)中HPSEC检测的具体条件为：色谱柱为Ultrahydrogel250，柱温为45℃，流动相为0.1mol/L硝酸钠，洗脱流速为0.5mL/min，进样体积为15μL，采用0.1mol/L硝酸钠配制2.5mg/mL的莲藕多糖样液，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。具体的，所述多糖HPSEC-UV标准指纹图谱包括5个共有特征峰，其对应的保留时间依次为：12.55min、13.23min、13.53min、13.84min、15.39min。具体的，所述多糖HPSEC-UV标准指纹图谱包括7个共有特征峰，其对应的保留时间依次为：13.00min、13.82min、14.30min、15.07min、15.47min、15.90min、16.80min。具体的，步骤4)中多个不同品种莲藕的数量为13个以上。本专利技术的有益效果是：本专利技术以不同品种及不同部位的莲藕多糖为研究对象，以多个莲藕多糖样品HPSEC-RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-RI标准指纹图谱，以此为参照图谱，采用相关系数(R)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位莲藕多糖HPSEC-RI图谱的相似性，发现不同品种及不同部位莲藕多糖的HPSEC-RI指纹特征具有明显差异，可以作为莲藕品种鉴别的重要依据；本专利技术同时还以多个莲藕多糖样品HPSEC-UV图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-UV标准指纹图谱，以此为参照图谱，采用相关系数(R)和夹角余弦(cosθ)进行相似性分析，发现有一些品种莲藕的不同部位对应多糖的HPSEC-UV图谱相似度较高，而另一些品种莲藕的不同部位对应的HPSEC-UV图谱的指纹特征具有明显异，故HPSEC-UV指纹图谱可作为HPSEC-RI指纹图谱的补充，两者配合可更加准确的反映莲藕多糖的结构特征，弥补单一HPSEC图谱指纹信息单薄的缺陷，以更加准确有效的对莲藕品种进行鉴别，同时也可进行莲藕多糖的真实性鉴别；以从多个品种莲藕的藕皮、藕节和食用部位提取的多糖为研究对象，整合莲藕资源中多糖的多维数据体系，增加了指纹图谱信息的全面性和可靠性。附图说明图1为莲藕多糖的HPSEC-RI指纹图谱，其中a和b分别为莲藕食用部位多糖HPSEC-RI指纹图谱及其标准图谱、c和d分别为藕皮多糖HPSEC-RI指纹图谱及其标准图谱；e和f分别为藕节多糖HPSEC-RI指纹图谱及其标准图谱；g为不同品种及不同部位莲藕多糖HPSEC-RI标准指纹图谱。图2为莲藕多糖的HPSEC-RI指纹图谱，其中a和b分别为莲藕食用部位多糖HPSEC-UV指纹图谱及其标准图谱；c和d分别为藕皮多糖HPSEC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取莲藕洗净后切分为藕段和藕节，藕段刨取皮部得到藕皮和食用部位，藕节切除须根，将藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别粉碎至5～20目，待用；2)将步骤1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别进行多糖提取处理，分别得到相应的三份莲藕多糖样品；3)以步骤2)得到的三份莲藕多糖样品为测试对象，采用HPSEC检测多糖样品的分子量分布，检测时将UV检测器和RI检测器串联使用，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位相应的多糖HPSEC‑UV图谱和多糖HPSEC‑RI图谱；4)多次重复步骤1)、2)和3)分别得到多个不同品种莲藕的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位的多糖HPSEC‑UV图谱和多糖HPSEC‑RI图谱，以所有多糖HPSEC‑UV图谱的平均向量构建得多糖HPSEC‑UV标准指纹图谱，以所有多糖HPSEC‑RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC‑RI标准指纹图谱，则完成莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建。

【技术特征摘要】
1.一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取莲藕洗净后切分为藕段和藕节，藕段刨取皮部得到藕皮和食用部位，藕节切除须根，将藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别粉碎至5～20目，待用；2)将步骤1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别进行多糖提取处理，分别得到相应的三份莲藕多糖样品；3)以步骤2)得到的三份莲藕多糖样品为测试对象，采用HPSEC检测多糖样品的分子量分布，检测时将UV检测器和RI检测器串联使用，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位相应的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱；4)多次重复步骤1)、2)和3)分别得到多个不同品种莲藕的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位的多糖HPSEC-UV图谱和多糖HPSEC-RI图谱，以所有多糖HPSEC-UV图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-UV标准指纹图谱，以所有多糖HPSEC-RI图谱的平均向量构建得多糖HPSEC-RI标准指纹图谱，则完成莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建。2.根据权利要求1所述的一种莲藕多糖HPSEC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤2)中的多糖提取处理的具体内容为：将供试部位按料液比1g:15mL加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至pH4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至...

【专利技术属性】
技术研发人员：易阳，王宏勋，孙杰，王丽梅，闵婷，侯温甫，艾有伟，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42