应用聚乙二醇修饰基因工程蛋白质的方法技术

应用聚乙二醇修饰基因工程蛋白质的方法，将蛋白质溶液加入相应的填料中搅拌反应，使蛋白质均匀地吸附在填料上，然后将吸附蛋白质的填料滤干，加入含活性聚乙二醇（ＰＥＧ）溶液中，充分搅拌反应，使活性聚乙二醇（ＰＥＧ）与蛋白质共价结合，然后将填料装柱、洗脱并收集ＰＥＧ修饰的蛋白质，使蛋白质的修饰及修饰后的蛋白质的分离一步完成。这种新颖的方法一搅拌填料反应法解决了上述文献中生产单聚乙二醇化蛋白质药物产率低下的问题（最高不超过６０％），使生产单聚乙二醇化蛋白质的转化率达到９０％以上，并且ＰＥＧ与蛋白质结合位点均一，体外活性保留与其他方法相当。ＰＥＧ修饰降低了蛋白质的免疫原性，增加了蛋白质的稳定性，延长了蛋白质在体内的半衰期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质化学领域，具体是应用搅拌填料反应法生产单聚乙二 醇化蛋白质药物，降低蛋白质的免疫原性，增加蛋白质的稳定性，延长蛋白 质在体内的半衰期。
技术介绍
二十世纪80年代，以干扰素为代表的一大类通过DNA技术开发的蛋白质 生物工程药物，给人类的一些难治性疾病提供了有效的治疗手段。经过30多 年的发展，此类蛋白质药物已成为国际市场上最重要的药物之一。去年的销 售值约为710亿至725亿美元，占全球药物市场的10%份额。但是30年的发 展中也发现了此类蛋白质药物也存在着很大的缺陷和不足，具体表现为稳 定性差，在体内易酶解和抗体中和而失去活性；相对分子量小易被肾脏排泄， 血浆半衰期短，易引起过敏反应。加大剂量给药虽可以提高疗效，但是不良 反应也随之增大。这些问题，影响着此类药物的发展和应用。近几年来，针对生物制药工程中存在的问题， 一种新的技术应运而生， 即应用聚乙二醇修饰此类蛋白质。聚乙二醇本身免疫原性极低，其聚醚骨架很难被酶降解。当聚乙二醇与 干扰素结合后，相对分子质量比干扰素大很多，同时聚乙二醇强大的亲水性， 增加了干扰素的水溶性，结合水分子后的干扰素分子大小比原分子扩大了 5 至10倍，给干扰素添加了屏蔽层，能够保护干扰素免受蛋白酶的降解。同时 屏蔽干扰素抗原决定簇，避免抗体的产生，降低干扰素的免疫原性，由于相 对分子质量较大而又具有分枝状结构，肾脏代谢减少。另外，聚乙二醇修饰 使干扰素的药代特性发生改变，延长在肝脏中的聚集时间，对肝脏的抗病毒 作用更有效。上述机制在临床上，可以使聚乙二醇化干扰素减少肾脏与细胞清除，延长半衰期，增强生物利用度，降低免疫原性，减少不良反应。目前 欧美等国称此类干扰素为长效干扰素，是治疗丙肝和恶性肿瘤的有效药物。欧盟专利(公开号0236987 )表明，a和Y -干扰素与活化PEG耦合 反应约在pH值7至9之间，欧盟专利(公开号0510356 )表明，a -干扰 素与含羰基吡啶或硫羰基活性基团的PEG耦合反应在pH值为7至9之间。美 国专利(公开号5， 382， 657)也表明水溶性的活性高分子聚合物与蛋白质的 赖氨酸残基反应也是在高ra值条件下进行的。然而，在液态条件下的共价耦合反应，活性高分子聚合物是随机与赖氨酸残基反应的，这会使蛋白质的活 性严重降低。我们采用了一种新的方法一搅拌填料反应法解决了上述文献中生产单聚 乙二醇化蛋白质药物产率低的问题(最高不超过60%)，使生产单聚乙二醇化 蛋白质的转化率达到90%以上，并且PEG与蛋白质结合位点均一，体外活性保 留与其他方法相当。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决修饰后产生的杂质与未修饰的PEG和蛋白质的 分离困难的问题，提供一种杂质与未修饰的PEG和蛋白质分离难度小的生产 单聚乙二醇化蛋白质药物的方法；本专利技术的另一个目的是提供一种单聚乙二 醇化蛋白质的转化率高的生产单聚乙二醇化蛋白质药物的方法。本专利技术的技术方案为，将浓 度l 8毫克/毫升的蛋白质溶液加入装有填料的容器中，搅拌1 4小时，搅 拌速度为20 200转/分钟，使蛋白质均匀地吸附在填料上；然后将吸附蛋白 质的填料滤干，加入浓度为相对蛋白质浓度的3 8倍摩尔比活性高分子聚合 物溶液中，搅拌1 12小时，反应温度为4°C 23°C，搅拌速度为20 200转 /分钟，使活性聚乙二醇与蛋白质共价结合;然后将填料装柱、用缓冲液梯度 洗脱分离，并收集单PEG修饰的蛋白质。上文所述的蛋白质是干扰素a-2b，上文所述的水溶性高分子是聚乙二醇，理想的情况是，活性水溶性聚合物的溶液里应包括还原剂。洗脱PEG修饰物 时要用合适的缓冲溶液，要求溶液对于柱填料具有比对蛋白质更高的吸附性， 并要求水溶性高分子与蛋白质的摩尔数量比是3至5左右。本专利技术使绝大多数吸附在柱填料上的干扰素a-2b只与一个分子的活性聚 乙二醇(PEG)结合，极大提高了单聚乙二醇化干扰素的产率。本专利技术的另一个优势是使用的原料较少，能更有效地除去未反应的聚合 物和其他杂质，收集修饰的蛋白质。这项专利技术可以在PEG化的过程使聚合物中蛋白保持生物活性，降低免疫 原性，以及增加在体内的半衰期。下面对本专利技术作进一步的说明首先把蛋白质吸附在柱填料上。很多种柱填料可以吸附蛋白质，例如， 离子交换树脂，疏水柱填料及亲和层析柱填料。在吸附蛋白质之前，理想情况是，柱填料与缓冲溶液达到动态平衡。一 般的缓冲溶液，如三羟甲基氨基甲烷一盐酸，醋酸盐和磷酸盐缓冲液，均可 使用。以上溶液的pH值可被控制，其值取决于水溶性聚合物，比如水溶性高 分子聚合物的功能团种类以及将要交联的蛋白质的种类，但一般使用pH值l.O 至11.0之间，建议pH值为3.0至9.0之间。为将蛋白质均匀吸附到柱填料上，建议将蛋白浓度调整为1至4毫克/毫 升的蛋白质溶液按体积比1-3:1加入装有填料的容器中搅拌反应。蛋白质充 分地、均匀地吸附到柱填料上后，将填料滤干(滤液中的未结合蛋白质可以 回收使用)。接下来，将滤干的填料加入活性水溶性高分子聚合物溶液中(v/vl:2) 充分搅拌反应，吸附在柱上的蛋白质与活性水溶性高分子聚合物共价结合。 充分反应后，将填料装入层析柱内，根据蛋白质及填料的性质选择合适的不 同离子强度的缓冲液将结合活件水溶性高分子聚合物的蛋白质与未结合活性 水溶性高分子聚合物的蛋白质分别洗脱下来，最终得到纯的单活性水溶性高分子聚合物修饰的蛋白质。上文所述的活性水溶性高分子包含多种功能团，如醛，丁二酰亚胺基戊二酸(SG) ， 丁二酰亚胺基碳酸(SC)， N-琥珀酰並扭，N-二邻苯二甲酰亚 胺，N -二戊二酰亚胺。合适的水溶性高分子，可以选择聚乙二醇(PEG )，右旋糖酐，聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，多糖类聚合物及其衍生物。 建议的水溶性高分子是带活性基团为SG或醛官能团的聚乙二醇(PEG )。上文所述的水溶性高分子的用量，相对于吸附在柱填料里的蛋白质，可 用3至7倍的摩尔比，建议4至6倍。在这一点上，如果摩尔比低于3 ，蛋 白聚合物的交联就不会发生，而即使比值超过7 ， PEG化的效率也不会有更 多的改善。从层析柱中洗脱蛋白聚合物的结合物。为了做到这一点，我们可以利用 缓冲溶液，要求溶液对于固相柱的吸附性强过蛋白质，让它通过固相柱，用 以洗脱PEG修饰的蛋白质。例如，在离子交换柱里，我们可以使用离子交换 反应洗脱PEG修饰的蛋白质，通过具有高强度离子的盐。这种强离子缓冲溶 液，可以通过加入100毫摩到10摩的盐类，如氯化钾，氯化钠，磷酸氢二钾， 磷酸钾，磷酸氢二钠，碳酸氢钠，硼酸钠和碳酸铵到-般的缓冲溶液，进行 梯度洗脱。 ' 附图说明图1为PEG修饰干扰素a-2b的柱洗脱紫外光吸收图谱； 图2为PEG修饰干扰素a-2b的SDS-PAGE分析图。图1显示了洗脱溶液在280纳米左右的紫外光吸收峰型，当活化聚乙二 醇溶液通过固相柱时，有单峰(聚乙二醇化干扰素单体)，显示所有干扰素结 合物为单一 PEG修饰的蛋白质。原先的干扰素已经被洗脱。图2显示了 SDS - PAGE的分析结果；M道是标准的标记参照物，1道是 原先的干扰素和2道是从固相柱里洗脱的干扰素。图6显示，当PEG通过固相柱，原先的干扰素带消失，而新的单一 P本文档来自技高网...

【技术保护点】
应用聚乙二醇修饰基因工程蛋白质的方法，将浓度１～８毫克／毫升的蛋白质溶液加入装有填料的容器中，搅拌１～４小时，搅拌速度为２０～２００转／分钟，使蛋白质均匀地吸附在填料上；然后将吸附蛋白质的填料滤干，加入浓度为相对蛋白质浓度的３～７倍摩尔比活性高分子聚合物溶液中，搅拌１～１２小时，反应温度为４℃～２３℃，搅拌速度为２０～２００转／分钟，使活性聚乙二醇与蛋白质共价结合；然后将填料装柱、用缓冲液梯度洗脱分离，并收集单ＰＥＧ修饰的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁国栋，张明杰，李圭哲，陈海宁，符启骄，周湘龙，
申请(专利权)人：海南海梁生物高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]