酵母重组株及IFNα-la干扰素的纯化方法技术

本发明专利技术涉及分泌表达α－１ａ干扰素的酵母工程菌株ＩＦＮ　　α－１ａ／ｐＧＡＰＺ　　α－Ａ／ＧＳ１１５构建的关键技术、构建结果及利用它来生产α－１ａ干扰素的纯化方法。本发明专利技术采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体表达系统，目标蛋白α－１ａ干扰素不需要复性，其生物比活性可达到１．０×１０↑［９］单位／毫克蛋白，低毒副作用；在纯化过程中，不需要价值昂贵的单抗柱，即可从发酵液中提取获得纯度达９５％以上的目标蛋白α－１ａ干扰素，降低了生产成本。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利说明酵母重组株及IFNα-1a干扰素的纯化方法 本专利技术涉及分泌表达α-1a干扰素的工程菌株及利用它来生产α-1a干扰素的纯化方法。目前，国内生产的α-1a干扰素，多为大肠杆菌表达产物，主要工艺缺陷是大肠杆菌的表达系统为包含体型，生产过程中需要复性，复性率低，最高为40％，因而比活性低，只有1.0×108单位/毫克蛋白，有较大的副作用；并且，分离纯化中要用价值昂贵的单抗柱，纯度才能达到95％以上；而目前国产的单抗柱，无论在产量和质量上，都不能够满足厂家需要，需要花大量经费进口，生产成本很高。为了克服上述缺陷，本专利技术采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体表达系统，目标蛋白α-1a干扰素不需要复性，其生物比活性可达到6.0×108单位/毫克蛋白，毒副作用低；在纯化过程中，不需要价值昂贵的单抗柱，即可从发酵液中提取获得纯度达95％以上的目标蛋白α-1a干扰素，降低了生产成本。α-1a干扰素酵母重组株的构建方法为将克隆修饰的α-1a干扰素基因插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游位点，删除Kex2(Lys-Arg)位点之后的Ste13位点(Glu-Ala-Glu-Ala)和启始密码子ATG，构建成α-1a干扰素基因分泌型表达载体；利用澳大利亚Invitrogen公司的Pichia EasyComp Transformation Kit的方法作改进，将α-1a干扰素基因分泌型表达载体转化毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115，构建成分泌型表达α-1a干扰素的酵母工程菌株--IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115；通过抗生素筛选、SDS-PAGE分析及生物比活性测定，获得目标酵母重组株。上述的酵母重组株目标蛋白α-1a干扰素的表达量为目标蛋白占分泌总蛋白的50-60％，比活性为1.08×109单位/毫克蛋白；目标蛋白α-1a干扰素具有与天然α-1a干扰素相同的免疫原性。本工程菌株接受外源基因是以整合于基因组形式，这与大肠杆菌、酿酒酵母的独立染色体组外质粒表达体系有显著差别，故本工程菌株较大肠杆菌、酿酒酵母稳定，不易发生外源基因丢失现象，一旦以工程菌作为样品模板，通过PCR、分子杂交等技术鉴定选择出来的阳性菌株一定是真实可靠的，且其目标表达产物α-1a直接表达分泌在培养液中，因此检测其蛋白表达量及目标产物的生物活性非常简易，这较大肠杆菌表达体系—表达产物需复性—优越得多；另外，酵母是一种简单的真核生物，因此其表达后加工模式类似高等真核生物，故用它表达的基因产物不仅具有天然产物相同的生物活性，而且低毒副作用，产品加工成本低，适用性更广。α-1a干扰素的纯化方法为利用获得的高产物表达量、高产物活性的酵母重组株进行发酵，离心收集上清液，以醋酸调节pH，过阳离子层析柱，收集目标洗脱峰，加硫酸铵至稍混浊，离心取上清液，过疏水层析柱，收集目标洗脱峰，过阴离子层析柱，收集目标洗脱峰，过Sephacryl分子筛层析柱，收集目标峰，得到α-1a干扰素。本专利技术提供的α-1a干扰素的纯化方法，缩短了纯化时间，不需要价格昂贵的单抗柱就可以得到纯度大于95％的α-1a干扰素原液，降低了成本，在工业生产中应用将良好的经济效益。附图为α-1a干扰素表达载体构建图。pGAPZα-A/IFNα-1a表达载体分子大小为3.6kbpGAPZα-A载体结构为磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子区域第1-483bp磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点第455-476bpα-交配因子分泌信号肽序列第493-759bpα-交配因子分泌信号肽引物位点第696-716bp载体多克隆位点第760-828bpmyc抗原决定簇包第827-856bp多聚组氨酸包第872-889bp3’-乙醇氧化酶1基因引物位点第974-994bp乙醇氧化酶1转录终止区域第893-1233bp转录延伸因子1启动子区域第1234-1644bp合成原核启动子第1645-1712bp链霉菌zeocin抗性基因阅读框第1713-2087bp细胞色素合成酶1转录终止区域第2088-2405bp大肠杆菌复制子1(来源于pUC载体)第2416-3089bp[具体实施方式]下面结合实施例详细介绍本专利技术在α-1a干扰素重组酵母工程菌株的构建和α-1a干扰素纯化工艺中的具体应用。实施例1一、IFNα-1a干扰素酵母工程菌的构建(一)材料1.IFNα-1a基因2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)购自澳大利亚Invitrogen公司。(二)方法1.基因PCR扩增(1)引物设计在5’端引物中删除Kex2(Lys-Arg)位点之后的Ste13位点(Glu-Ala-Glu-Ala)和启始密码子ATG。P1-5’GCTCGAGAAAAGAATGTGTGATCTGCCTCAAACC3’(“ATG”被删除)Xho I Lys-Arg(Kex2位点)P2-5’GTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACT3’XbaI(2)热循环95℃，5’；95℃，30”→49℃，30”→72℃，60”72℃，10’扩增30个循环。2.PCR扩增产物回收与克隆(1)IFNα-1a基因经扩增电泳后获得约521bp的DNA带；(2)用德国宝灵曼公司生产的PCR产物高纯度试剂盒回收目标片段并进行T-Vector克隆。3.基因序列分析采用美国PE公司生产的ABI 377A DNA自动测序仪进行DNA序列分析。4.酵母分泌型表达载体构建采用基因克隆技术将α-1a干扰素基因通过XhoI/XbaI插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游的Xho I/Xba I位点，构建成含α-factor信号肽的分泌型酵母表达载体；表达载体转化GS115(his4)利用澳大利亚Invitrogen公司生产的PichiaEasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)经稍作改进的方法进行。具体操作如下(1)挑取毕赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115单菌落，在30℃，300转/分钟条件下以YPD+Zeocin100毫克/升培养基振荡培养至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同样培养基中振荡培养至OD600＝6-8，在5000转/分钟、4℃条件下离心5分钟，去上清液，用10毫升溶液I重悬，制成感受态细胞；(2)取100微升感受态，加入5-10微升线性化的α-1a干扰素重组表达载体，再加400毫升溶液II，混匀后28℃培养1小时，加1毫升YPD，30℃培养1小时；(3)将培养物在5000转/分钟、4℃条件下离心15分钟，去上清，用200毫升溶液III重悬，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培养24-36小时，产生单菌落。5.高表达酵母工程菌株的筛选用Zeocin抗生素筛选获得阳性菌株后，提取工程菌基因组DNA，进一步以引物P1/P2作PCR分析和以德国宝灵公司生产的DiG Labelling and Detection Kit标记α-1a干扰素基因之520bp DNA片段为探针，进行Southern blotting等技术鉴定筛选出阳性菌株，再用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵母重组株，其特征在于将克隆修饰的α－１ａ干扰素基因插入ｐＧＡＰＺ　　α－Ａ之ＧＡＰ启动子／α－ｆａｃｔｏｒ信号肽下游位点，删除Ｋｅｘ２（Ｌｙｓ－Ａｒｇ）位点之后的Ｓｔｅ１３位点（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｌａ）和启始密码子ＡＴＧ，构建成α－１ａ干扰素基因分泌型表达载体ＩＦＮ　　α－１ａ／ｐＧＡＰＺ　　α－Ａ，转入毕赤氏酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）的菌株ＧＳ１１５，构建成分泌型α－１ａ干扰素的酵母重组株ＩＦＮ　　α－１ａ／ｐＧＡＰＺ　　α－Ａ／ＧＳ１１５。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁国栋，周鹏，夏中宁，
申请(专利权)人：海南海梁生物高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]