一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒及其使用方法技术

一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于：探针设计序列如下：FAM‑CCTAGA TGCGCTTCTTGATGTCGAC TCTAGG‑DABCYL，试剂盒组成如下：

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒及其使用方法，属于鉴别诊断试剂盒的研发领域。
技术介绍
诺卡氏菌属（Nocardia）为需氧放线菌，是土壤中腐生菌，不是人和动物体内的正常菌群。诺卡菌感染既可发生在健康人外伤后，又可引起免疫缺陷患者致死性感染，当吸入或者由外伤进入人体后，可引起肺部及皮下组织的感染，也可播散至全身，引起各种内脏器官发生感染。诺卡氏菌属中对人或动物治病的的病原体至少有25个种，从人体内分离出来的诺卡菌，星形诺卡氏菌占90%，巴西诺卡氏菌占7%，而豚鼠诺卡菌占3%。有报道称，星形诺卡氏菌是需氧放线菌中最常见的动物病原体，最常见的动物疾病为牛乳腺炎，也曾被报道引起鱼类感染。在临床上除非是已经怀疑有相应感染可能性，需氧放线菌通常会被漏诊或误诊，目前常规使用的诺卡氏菌分离培养、生理生化反应及经典的PCR技术等检测方法操作繁琐、耗时长、灵敏度低，不适于临床上快速鉴别诊断。因此，建立诺卡氏菌的快速、可靠、特异、灵敏且操作简单的检测方法十分必要。基因诊断直接检测临床标本感染病原体的基因,属病因诊断，在疾病预防、诊断及疗效考核等各方面都有重要意义。经典的采用琼脂糖凝胶电泳等手段对检测结果观察分析，人为误差大，假阳性、假阴性率高。荧光偏振技术检测偏振光强度而非荧光强度，灵敏度高，快速、简单和准确，是特别用于研究分子间相互作用的技术。这种方法直接及时的检测示踪分子的结合/自由率。荧光偏振实验在没有固相支持的溶液中进行，允许在低至皮摩尔级的范围内分析真实的平衡。荧光偏振检测并不掺杂样品，因此样品可以被再次处理并被重新分析用于评价pH、温度和盐浓度改变对结合的影响。此外，荧光偏振实验是实时进行的，并不局限于平衡结合的研究。TDI反应是在DNA模板引导下的引物末端延伸反应，通过引物扩增、确定特异探针与靶DNA的识别杂交及在模扳指导下在特定位臵特异硷基掺入三重把关，决定基因型，从而确保反应的特异性。特异性基因是诺卡氏菌存在的最直接的标志，有多项研究表明，在以核苷酸序列为基础的放线菌分类及鉴别研究中，16SrRNA序列难以区分某些种，而看家基因secA1的序列具有足够的保守性以及可变性，可作为区分不同种的靶分子。Sec系统是相当保守的分泌机制，在古菌、细菌及真核生物中都存在。Sec分泌途径在细菌中，尤其是大肠杆菌已得到了广泛的研究。secA1蛋白（具ATPase活性）作为前体蛋白转位酶的重要成分，为蛋白的跨质膜输送提供驱动力。最近有多项研究表明，在以核苷酸序列为基础的放线菌分类及鉴别研究中，16SrRNA序列难以区分某些种，而看家基因secA1的序列具有足够的保守性以及可变性，可作为区分不同种的靶分子。Fischer等扩增了分枝杆菌属29个种的47株ATCC标准菌和59株临床分离菌的secA1基因序列，首次发现分泌相关基因可以用于区分分枝杆菌属内的不同菌种。Conville等分析比较了诺卡氏菌属的29个种的16SrRNA以及secA1基因序列，发现secA1基因能更好更准确地区分和鉴别诺卡氏菌属内的菌种。同样地，我们在对戈登氏属的23个模式种分别进行了secA1基因和16SrRNA系统进化关系的比较分析，而后得出结论，secA1作为看家基因用来进行种水平的鉴定以系统进化的研究，是非常理想的靶标。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题：设计一种能够特异性扩增的分子信标探针，采用实荧光定量PCR方法，从而研发能够鉴别临床常见病原需氧放线菌中诺卡氏菌的诊断试剂盒，可以克服现在病原性放线菌的快速鉴别、鉴定和诊断的困难颈瓶。本专利技术的技术方案是：一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒，分子信标探针设计序列如下：FAM-CCTAGATGCGCTTCTTGATGTCGACTCTAGG-DABCYL，试剂盒组成如下：1PCRMix1.0mL×5瓶2secA1上游引物0.5mL×1瓶3secA1下游引物0.5mL×1瓶4分子信标探针0.5mL×1瓶5双蒸水1.0mL×5瓶6无菌八排管8个×7条7无菌八排管盖8个×7条8说明书1份一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒的使用方法，采用20μL体系：PCRMix10μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，分子信标探针1μL，双蒸水6μL；随后进行实时荧光定量PCR，其扩增条件是：预变性：94℃4min；①变性：94℃，30s；②退火：58℃，50s；③延伸：72℃，90s；①②③循环40次，最后72℃延伸10min。按照一般杂交探针设计的要求，根据GenBank上公布的诺卡氏菌菌株SecA1基因序列，采用Primer软件设计分子信标探针，并将选取的19bp的DNA片段与诺卡氏菌属菌株基因组DNA序列进行同源比较，确定是一段无同源片段的特异性DNA。再按照分子信标探针设计的要求，在19bp特异性DNA片段的5’和3’端分别添加互补的且与目的DNA无关的6个碱基臂，5’端为CCTAGA，3’端为TCTAGG，形成一个发卡结构（如图2）,19bp特异性DNA构成发夹的噜扑环，6个互补碱基配对形成发夹的茎。在发夹结构的5’端标记荧光素FAM，3’端标记淬灭剂DABCYL。本专利技术的有益效果：国内学者刘璐等专利技术了一种鰤鱼诺卡氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的鰤鱼诺卡氏菌，但不能用于临床病人感染诺卡氏菌的快速检测；而目前临床医生常用于检测病原需氧放线菌的试剂盒可在6小时内检测临床常见的17种分枝杆菌：结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加-玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌及耻垢分枝杆菌，但不能检测诺卡氏菌。与现有技术比较，本专利技术通过设计可检测诺卡氏菌secA1基因分子信标探针，可不用测序即可对其进行鉴定和诊断，解决了病原性放线菌的快速鉴别，鉴定和诊断的困难颈瓶，节约鉴定成本且操作简单。专利技术人发现，对于放线菌目中的几种主要相关菌属如诺卡氏菌属、戈登氏菌属、分枝杆菌属、链霉菌属等的secA１基因翻译出来的氨基酸序列，不同属别的菌种各有其特异性的基序（motif）。根据我们前期研究中的发现，可以设计出特异性扩增引物及探针，采用分子信标探针结合实时荧光定量PCR的方法，研发在不同的反应体系中应用其特异性的引物，同步检测鉴别不同放线菌属的菌种的诊断试剂盒，使得对病原菌的临床检测快速、可靠、特异及操作简单，尤其能降低多重混合感染的漏诊率和检测成本，可以提高检验效率，与测序检测方法符合率高,敏感度高。附图说明图1为不同菌株的实时荧光PCR结果；A：诺卡氏菌CMCC(F)D4CsecA1基因扩增结果；B：戈登氏菌IFM10866secA1基因扩增结果；C：马红球菌CMCC(F)D4BsecA1基因扩增结果；D：阴性对照（诺卡氏菌CMCC(F)D4C不加探针secA1基因扩增结果）；E：空白对照（水加探针）；图2为分子信标探针示意图；图3为诺卡氏菌secA1基因PCR扩增结果；M：DL2000；1-5：诺卡氏菌CMCC(F)D4CsecA1基因扩增结果；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于：分子信标探针设计序列如下：FAM‑CCTAGATGCGCTTCTTGATGTCGAC TCTAGG‑DABCYL，试剂盒组成如下：

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于：分子信标探针设计序列如下：FAM-CCTAGATGCGCTTCTTGATGTCGACTCTAGG-DABCYL，试剂盒组成如下：1PCRMix1.0mL×5瓶2secA1上游引物0.5mL×1瓶3secA1下游引物0.5mL×1瓶4分子信标探针0.5mL×1瓶5双蒸水1.0mL×5瓶6诺卡氏菌阳性标准品0.5mL×1瓶7无菌八排管8个×7条8无菌八排管盖8个×7条9说明书1份。2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于：所述的分子信标探针的设计：根据GenBank上公布的诺卡氏菌菌株secA1基因序列，采用Primer软件设计分子信标探针，并将选取的19bp的DNA片段与诺卡氏菌属菌株基因组DNA序列进行同源比较，确定一段无同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：康颖倩，王颜颜，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52