一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用。葡萄糖脱氢酶突变体基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。一种葡萄糖脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌。并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组葡萄糖脱氢酶的制备。本发明专利技术提供一种催化活性、pH及热稳定性、有机溶剂耐受性较好的葡萄糖脱氢酶突变体，可用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
氧化还原酶被广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸等药物中间体，绝大多数氧化还原反应都需要辅酶NAD(P)H的参与。因辅酶价格昂贵，稳定性差、难以重复利用，严重限制了氧化还原酶的工业化应用，构建高效、经济的辅酶再生体系对于解除辅酶含量对反应的限制、降低生产成本极为重要。辅酶再生的方法可分为全细胞法、光化学法、化学法、电化学法和酶法等。酶法再生还原态辅酶由于对辅酶的选择性及再生效率高，且再生系统与合成系统兼容性好，因而最受青睐。葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase,GDH，EC1.1.1.47)属于短链醇脱氢酶家族，由4个相同的亚基组成，广泛存在于原核与真核生物中。葡萄糖脱氢酶根据其所结合的辅酶可分为三种类型：吡咯喹啉醌依赖型、FAD依赖型及NAD(P)+依赖型。其中NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶可特异性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H，从而解决NADH以及更为昂贵的NADPH的再生问题。由于其对辅酶NAD(P)+的比活高，对还原性辅酶NAD(P)H的再生能力强，且既可用于NADH的再生，又可用于NADPH的再生，NAD(P)+依赖型葡萄糖脱氢酶得到了广泛的应用。该酶可从多种微生物如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)及巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)等中获得。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种葡萄糖脱氢酶突变体。本专利技术的另一目的是提供该葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法。本专利技术的又一目的是提供该葡萄糖脱氢酶突变体的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：葡萄糖脱氢酶突变体基因，其野生型基因其来源为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisT1(GenBank:KU682779.1)，根据易错PCR方法对其进行突变，从而获得该氨基转移酶突变体目的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。一种葡萄糖脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的重组载体。其可通过本领域常规方法将本专利技术的葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒pUC18，pUC19，pET系列等，更优选地选自pET系列。本专利技术的一个实施例中所使用的质粒为pET-28a。一种生产所述的葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本专利技术所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因或本专利技术所述的重组载体。所述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。所述基因工程菌优选保藏号为CCTCCM2016059的E.ColiG06，于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。本专利技术所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因、所述的重组载体、所述的基因工程菌在制备葡萄糖脱氢酶中的应用。一种葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本专利技术所述的基因工程菌，获得重组表达的葡萄糖脱氢酶突变体。所述的方法，优选包括在发酵条件下，制备所述葡萄糖脱氢酶的步骤。本专利技术所述的葡萄糖脱氢酶突变体在氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生中的应用。有益效果：本专利技术提供一种催化活性、pH及热稳定性、有机溶剂耐受性较好的葡萄糖脱氢酶突变体，可用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。生物材料保藏信息大肠杆菌G06EscherichiacoliG06，已于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2016059。具体实施方式实施例1基因工程菌的建立根据NCBI收录的葡萄糖脱氢酶基因GDH(GenBank:KU682779.1)，人工合成该葡萄糖脱氢酶基因片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加NdeⅠ和BamHⅠ内切酶片段)其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入pET-28a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立葡萄糖脱氢酶基因工程菌。其中PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因的引物为：上游引物为F1:5'-GGGCCATATGATGGACATGTATCCGGATT-3'(SEQIDNO.4)，下游引物为R1:5'-GCGGGGATCCTTAGCGGCCTGCCTGGAAT-3'(SEQIDNO.5)。实施例2葡萄糖脱氢酶突变体基因的获得本研究利用易错PCR方法对葡萄糖脱氢酶进行了蛋白质工程改造。50μlPCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA1.5μg，TaqDNA聚合酶0.5μL，Mg2+2mmol/L，加双蒸水至50μl。PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；于72℃下继续延伸5min，冷却至4℃，结束反应。实验流程化学合成葡萄糖脱氢酶基因并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET-28a质粒中，作为基因突变模板；易错PCR扩增葡萄糖脱氢酶的基因，扩增后基因片段链接至pET-28a载体，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立葡萄糖脱氢酶基因突变体库；利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a质粒为载体，表达扩展葡萄糖脱氢酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活性葡萄糖脱氢酶基因进行鉴定。筛选出的高活性葡萄糖脱氢酶突变体基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1所示的高活性葡萄糖脱氢酶突变体基因可以通过化学合成方式获得。葡萄糖脱氢酶基因的引物为：上游引物为F1:5'-GGGCCATATGATGGACATGTATCCGGATT-3'(SEQIDNO.4)，下游引物为R1:5'-GCGGGGATCCTTAGCGGCCTGCCTGGAAT-3'(SEQIDNO.5)。按实施例1所述方法构建表达该葡萄糖脱氢酶多肽突变体的基因工程菌，并将其命名为E.ColiG06，于2016年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2016059。实施例3重组大肠杆菌的摇瓶培养将实施例1、实施例2所得的重组大肠杆菌分别接种至装有5mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养4-8小时。取1mL菌体培养液转接至装有50mLLB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，于22-26℃、200rpm诱导表达8-12小时后，离心(8000rpm，15min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(pH7.5，10mmol/L)清洗两次，分散于同样的预冷的缓冲液中，于冰水浴中进行超声破本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖脱氢酶突变体基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的重组载体。4.一种生产权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中包含权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因或权利要求3所述的重组载体。5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichiaco...

【专利技术属性】
技术研发人员：石利平，陈峻青，蔡进，漆志文，张维冰，叶银梅，徐春涛，何义，陈晓佩，刘思琪，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32