一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法技术

本发明专利技术公开了一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，制备培养高质量的稻瘟病菌分生孢子，制备培养方法步骤如下：1)将普通三角瓶洁净备用；2)制备瓶式燕麦培养基；3)将稻瘟病菌菌丝体植入瓶式培养基；4)在28℃温度条件下产孢培养；5)洗脱收集分生孢子。本发明专利技术的优点是：1)高效防止污染，孢子成品质量较高；2)操作技术简单；3)三角瓶内收集孢子比培养皿内收集孢子的操作更为方便；三角瓶的保护可使得产孢菌落能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要孢子的工作程序衔接。

【技术实现步骤摘要】
一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法
本专利技术涉及植物病理学技术，具体是一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法。
技术介绍
稻瘟病是全球水稻生产的重大病害，该病害的致病菌稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)是植物病理学的模式病原菌，国内外都期望通过对稻瘟病菌开展全面和深入的相关研究，以揭示植物病原菌对寄主植物致病的一般规律，进而寻求和建立更为有效可行的植物病害控防途径。分生孢子是稻瘟病菌的无性繁殖体，在稻瘟病的病害循环和病害流行中发挥重大作用。在实验室内，分生孢子也是稻瘟病研究不可缺少的材料。有关分生孢子的形成发育生理、对不良环境的生存适应性或抵抗性，孢子与寄主的识别互作反应等研究，都需要使用孢子形态的材料；新型防治药物研发方面的有关研究，如药剂对孢子的致毒效应等，也需要孢子；分子生物学领域的有关研究，如致病相关基因的诱变、定位与克隆等；也离不开孢子；可见，分生孢子是稻瘟病日常研究重要的菌体形态，因此，快速、高效地培养制备高质量的分生孢子材料，非常有利于稻瘟病有关研究工作的顺利实施。当前稻瘟病菌分生孢子的培养制备方法，主要有两大类技术。一类是采用植物籽粒作培养基的培养法，即先将植物籽粒(如大麦粒等)浸润并灭菌制成培养基，然后将菌丝体移植入籽粒培养基内培养，当菌丝长满籽粒后，用清水洗刷掉籽粒表面菌丝，并转放到方盘类器具内再进行光照培养；该方法通常能制备大量的分生孢子，不过，培养制备全程时间较长(一般需要18天以上)，成品孢子液难以避免杂菌污染，而且存在较多的培养基杂质。另一类是采用琼脂作凝固剂的培养皿培养法，即先将有关养分(如米糠煮出汁)与琼脂制成固体培养基并用培养皿倒成平板，然后将稻瘟病菌移植入培养皿内的培养基面上，再转到合适条件下培养；直至菌落形成，然后刮除菌落的气生菌丝，增加特定光照培养，直至形成孢子。该方法能克服前述方法的一些不足，如污染程度低，容易获得杂质少的纯净孢子成品；但培养所用的关键器具是培养皿，该类器具有个先天不足，就是培养皿内外是直通的，培养皿外面的污染空气很容易与皿内空气流通交换，因而很难避免培养皿内培养材料被污染，要获得完全没有杂菌污染的分生孢子材料，技术难度大。这对许多需要高质量、无污染状态的孢子的研究工作非常不利。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养方法的步骤如下：1.采用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。2.瓶式培养基的制备：用燕麦培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：燕麦167g，琼脂20g，水1000mL；将培养基分装于步骤1准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用。3.稻瘟病菌的移植：用移植工具将实验室常备的稻瘟病菌菌丝体，移植入步骤2制备的瓶式培养基上。4.培养产孢：将步骤3操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；通常培养7天后，瓶式培养基面上已形成菌丝密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。5.分生孢子的收集：用无菌水洗脱步骤4获得的菌落上的孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的稻瘟病菌分生孢子液。本专利技术的优点是：1)三角瓶配上常规瓶塞后，能阻隔普通微生物的通过，很好地保护三角瓶内不受杂菌污染，获得高质量的孢子成品。2)培养期间无需常规制备技术所需要的额外光照、中途也无需刮除菌丝，操作技术简单。3)三角瓶内收集孢子比培养皿内收集孢子的操作更为方便。4)三角瓶的保护可使得产孢菌落能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要孢子的工作程序衔接。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。本专利技术的关键技术是三角瓶与琼脂类培养基的结合与应用。三角瓶虽然属植物病理学实验室的日常器具，但其常规用途主要是装盛培养基灭菌；也常见用于装盛液体培养基、或植物组织类培养基(如籽粒、秸秆等)进行病原菌培养。琼脂类培养基的应用，现有的技术规范都是使用培养皿作培养器具，将琼脂培养基加热熔化后，倒入培养皿制成培养基平板，并在该培养平板上培养病原菌。稻瘟病菌分生孢子在琼脂培养基上的制备培养，均为应用常规的技术规范，即利用培养皿结合琼脂类培养基的培养技术进行制备培养；至今还未见有利用三角瓶作培养器具，在琼脂类培养基上进行稻瘟病菌产孢培养的孢子制备技术。可能原因是对培养皿的长期依赖及习惯沿用，以及通常认为病原菌产孢需要通气性良好的环境条件，而培养皿恰好能满足良好的通气性。普通三角瓶套上瓶塞后，虽然形成通气性较差的封闭环境，但专利技术人反复试验发现，稻瘟病菌能在该较为封闭的环境内的琼脂培养基上形成分生孢子；而三角瓶的应用，则正好解决应用培养皿容易导致污染的重大技术问题。稻瘟病菌可在多种琼脂培养基上形成孢子，本专利技术采用燕麦培养基作产孢培养基，其配比为：燕麦167g，琼脂20g，水1000mL；组分燕麦为用水煮开180分钟后取汁用。培养基煮配完毕后，可直接分装到三角瓶中；由于三角瓶底部多属曲面状态，培养基量过少会造成瓶底局部无培养基或培养基过薄，培养基过多则容易造成浪费；通常每瓶(250mL规格)装入20～30mL培养基为宜，其它规格的三角瓶酌情增减液量。套好瓶塞后，常规高压高温灭菌，灭菌后取出三角瓶平置于平直的桌面上，冷却后形成瓶式培养基。瓶式培养基也可以用另一种方法分装，先用较大的三角瓶按常规方式装入液量较多的培养基进行灭菌；再如同倒培养皿平板一样，使用前加热熔化后，分装到灭菌的空白三角瓶内。稻瘟病菌的移植可按常规方式移植，用普通菌落上的菌丝体作移植用的母体菌体；为加速培养进程，可在一个瓶式培养基上植入多块菌丝块。产孢培养可在普通培养箱内实施，温度控制在稻瘟病菌生长的适宜温度，以28℃为佳；培养过程中无需按常规实施刮除菌落表面菌丝，也无需增加特殊光照条件。通常产孢制备培养7天后，三角瓶内培养基面上能形成密集的气生菌丝和大量分生孢子。用无菌水收集获得的分生孢子，实际操作可用T形玻棒刷洗菌落，使孢子释放到洗孢水液中。实施例1应用本专利技术一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养稻瘟病菌菌株Mg2013-1的分生孢子，按如下步骤实施操作：1.采用250mL三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用。2.瓶式培养基的制备：用燕麦培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：燕麦167g，琼脂20g，水1000mL；将培养基分装于步骤1准备的三角瓶，每瓶30mL；常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用。3.稻瘟病菌的移植：用移植针将实验室常备的稻瘟病菌菌株Mg2013-1菌丝体，移植入步骤2制备的瓶式培养基上。4.培养产孢：将步骤3操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；7天后瓶式培养基面上形成菌丝密集的菌落，菌落上产生分生孢子。5.分生孢子的收集：取无菌水注入步骤4获得的一瓶菌落上，用T形玻棒刷洗菌落的孢子，能获得孢子浓度为105个/mL、无杂菌污染的较高质量的稻瘟病菌分生孢子液75mL。实施例2应用本专利技术一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，制备培养稻瘟病菌菌株Mg2015-15的分生孢子，按实施例1的步骤1至步骤5操本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，其特征在于，制备培养方法的步骤如下：1)用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用；2)瓶式培养基的制备：用燕麦培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：燕麦167g，琼脂20g，水1000mL；将培养基分装于步骤1)准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用；3)稻瘟病菌的移植：用移植工具将实验室常备的稻瘟病菌菌丝体，移植入步骤2)制备的瓶式培养基上；4)培养产孢：将步骤3)操作完备后的瓶式培养基转入温度为28℃的普通培养箱内培养；通常培养7天后，瓶式培养基面上已形成菌丝密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子：5)分生孢子的收集：用无菌水洗脱步骤4)获得的菌落上的分生孢子，并集中到灭菌容器内，即获得无杂菌污染的较高质量的稻瘟病菌分生孢子液。

【技术特征摘要】
1.一种高效防止污染的稻瘟病菌分生孢子的制备培养方法，其特征在于，制备培养方法的步骤如下：1)用普通三角瓶作制备培养孢子的器具，将三角瓶洁净备用；2)瓶式培养基的制备：用燕麦培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：燕麦167g，琼脂20g，水1000mL；将培养基分装于步骤1)准备的三角瓶，常规高压高温灭菌后成为瓶式培养基，备用；3)稻瘟病菌的移植：用移植工...

【专利技术属性】
技术研发人员：张君成，王忠文，蒲相君，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45