一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法技术

本发明专利技术涉及一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，属于植物保护和生物技术领域。本发明专利技术的技术方案是保持目前基因克隆与表达的方法，如引物设计、ＰＣＲ扩增、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ、连接、转化、蛋白表达均与常规相同，不同的是该基因为稻瘟病菌侵染水稻后期高度表达的基因，与前人研究的稻瘟病菌基因多为稻瘟病菌侵染早期高度表达的基因有区别，其编码产物是小蛋白，由８８个氨基酸组成，相对分子量为８．８ｋＤａ，其体外表达产物按照０．５ｍｇ／ｍｌ～２．５ｍｇ／ｍｌ的浓度直接接种到致伤的丽江新团黑谷水稻叶片后能引起水稻叶片产生病斑。本发明专利技术比传统稻瘟病菌致病性测定方法简便、快速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的 体外功能检测的方法，属于植物保护和生物

技术介绍
稻瘟病菌是研究较多植物致病真菌，其侵染过程始于分生孢子着落到 寄主表面，分生孢子依靠顶端的胶状物紧紧粘着在植物组织表面，在有水 滴的条件下很快萌发形成发芽管，并分化出附着胞。形成强大的压力使侵 入栓能够直接穿透寄主组织的角质层。成功侵入后，侵染菌丝就大量生长， 分化出多胞有分枝的菌丝体，在植物细胞内和细胞间延伸，最后形成病斑， 产生分生孢子，开始新的侵染。在侵染过程中，水稻和稻瘟病菌都有大量的基因参与。仅病菌方面， 就包括大类基因第一类是与侵染有关的形态分化过程信号识别基因；第 二类是与毒性相关的毒性决定因子和无毒基因，第三类是与病菌侵染水稻 组织后定殖扩展相关的基因。关于侵染早期的基因研究得较多，识别疏水信号的M户G7 、P77W/基因，进行信号传递的CPiC4， M4C7 、M4GB，尸MW ， MST7和MS777等基因，参与黑色素合成的^LBA万L^7和i Sn基因， 附着胞膨压形成的PTH2基因，侵入栓形成的尸LS7、MS7V2， M尸57、 0457、p/)五/、 cr尸7等基因，此外还有一些无毒基因，包括p『l入^ray-cow,^Fi -巧to, ^CE等。对于稻瘟病菌感染建立后在寄主组织内定殖发展阶段 的基因调控则研究得还不多。仅有P型ATP酶基因尸D五/和MgJP基因， Miff/与Woronin体形成的HEXl，而且其与病原菌在寄主体内扩展的机 制还不不清楚。我们从含有信号肽的小蛋白中，发现了一个表达产物能够 在水稻叶片上引起坏死斑的基因，通过RT-PCR检测，表明其在感染的第 四天达到最高，其表达量变化的特征表明该基因主要在侵染的后期大量表 达，可以作为稻瘟病病斑的形成和致病基因的研究的候选基因。目前，参与稻瘟病菌侵染早期的相关基因的研究已经取得了长足的发 展，而对稻瘟病菌侵染后期表达的基因却研究得较少。而且以往采用传统 的将稻瘟病菌株喷雾接种水稻叶片，10天后观察叶片表型变化的致病性测 定方法，这种方法容易受到气候、以及人为条件等环境因子的影响，现在 还没有一种直接用基因的原核表达产物接种致伤水稻叶片，以快速测定基 因是否是致病基因的方法。
技术实现思路
.-本专利技术的主要目的是克服现有传统稻瘟病菌致病性测定方法的不足， 提供一种快速、简便和准确的测定方法。本专利技术的技术方案是保持目前基因克隆与表达的方法，包括引物设 计、PCR扩增、real-time PCR、连接、转化、蛋白表达方法均与常规相同， 其特征在于该基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子 量为8.8kDa，其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGG腿TNIATIQANCQAECNTIFEIGQ该基因的体外表达产物按照0.5mg/ml 2.5mg/ml浓度直接接种到致伤 的丽江新团黑谷水稻叶片后能引起水稻叶片产生病斑，这种测定方法比传 统瘟病菌致病性测定方法简便、快速。 PCR扩增的引物序列为P04-F: 5'画CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3' P04-R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3' real-time PCR扩增的引物序列为 NIP04画F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3， NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3，本专利技术的有益效果是该基因为稻瘟病菌侵染水稻后期高度表达的基 因。采用其表达产物直接接种到致伤水稻叶片上，可直接定性地获得水稻 的抗感和与蛋白互作的情况，克服了传统致病性测定方法周期长、环境因 子影响大等弊端，最终达到为今后稻瘟病菌致病性测定提供简便有效的方法的目的。具体表现在以下两点l.该基因为稻瘟病菌侵染水稻后期高度表达的基因，与前人研究的稻瘟病菌基因多为稻瘟病菌侵染早期高度表达 的基因有区别。2.体外表达产物直接接种到水稻叶片上，两天后能直接观 察到水稻叶片的表型变化，定性获得蛋白与水稻互作的情况，克服了传统 致病性测定周期长、环境因子影响大等弊端。 具体实施方案实施例一基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa， 其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下-WSKSSQGGRMTNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR扩增的引物序列为P04-F: 5 ，-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3'P04画R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG國3' real-time PCR扩增的弓I物序列为 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3， NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3，将该基因的表达产物于4。C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲 液(20mM Tris-HCl， pH7.4; 200mM NaCl; lmM EDTA; 10mM e -巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是 将该基因的原核表达产物按照0.5mg/ml的浓度接种到水稻品种丽江新团 黑谷的致伤叶片上。对照是将空载体的原核表达产物按照0.5mg/ml的浓度 接种到致伤的水稻叶片上，两天后观察水稻叶片表型变化，结果见表l表1基因原核表达产物接种丽江新团黑谷水稻品种致伤叶片48小时表型变化类别蛋白浓度(mg/ml)48小时叶片表型变化处理0.50叶片致伤点周围出现褐色斑点对照0.50叶片致伤点周围没有出现褐色斑点实施例二.-基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa， 其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下WSKSSQGG腹TNIATIQANCQAECNTIFEIGQPCR扩增的引物序列为P04-F: 5'-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3' P04扁R: 5，- CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3' real-time PCR扩增的引物序列为 NIP04-F:5'-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3' NIP04-R:5'-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3，将该基因的表达产物于4C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲 液(20mMTris-HCl, pH7.4; 200mMNaCl; lmMEDTA; 10mM P-巯基 乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是 将该基因的原核表达产物按照2.5mg/ml的浓度接种到水稻品种合系24的 致伤叶片上。对照是将空载体的表达产物按照2.5mg/ml的浓度接种到致伤 的水稻叶片上，两天后观察水稻叶片表型变化，结果见表2。表2基因原核表达产物接种丽江新团黑谷水稻品种致伤叶片48小时表型变化类别蛋白浓度(mg/ml)48小时叶片表型变化处理2.50叶片致伤点周围出现连成片的褐色斑块对照2.50叶片致伤点周围没有出现褐色斑点实施例三基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa， 其编码基因的核酸序列和氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，保持目前基因克隆与表达的方法，包括引物设计、ＰＣＲ扩增、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ、连接、转化、蛋白表达方法均与常规相同，其特征在于该基因的编码产物是小蛋白，由８８个氨基酸组成，相对分子量为８．８ｋＤａ，其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下：　ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣ　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＣＣＧＣＣＴＣＡＡＴＡ ＴＡＣＧＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣ　ＡＣＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＣＣＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴＧＣＧＣＡＴＴＧ　ＣＧＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＡＧＧＣＧＧＴＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴ　ＣＧＣ ＣＡＣＣＡＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＴ　ＴＧＡＡＡＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡ　ＭＫＦＳＡＡＬＬＴＴＩＴＡＴＧＡＮＡＬＷＦＶＰＰＱＹＴＴＮＱＨＬＱＴＹＦＲＡＹＰＧＣＶＡＨＣ　ＥＴＷＳ ＫＳＳＱＧＧＲＭＴＮＩＡＴＩＱＡＮＣＱＡＥＣＮＴＩＦＥＩＧＱ　该基因的体外表达产物按照０．５ｍｇ／ｍｌ～２．５ｍｇ／ｍｌ浓度直接接种到致伤的水稻叶片后引起水稻叶片致伤点周围产生褐色斑点。...

【技术特征摘要】
1、一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，保持目前基因克隆与表达的方法，包括引物设计、PCR扩增、real-time PCR、连接、转化、蛋白表达方法均与常规相同，其特征在于该基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa，其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下ATGAAGTTCTCTGCCGCCCTTTTGACCACCATCACCGCCACCGGCGCCAACGCTCTCTGGTTCGTGCCGCCTCAATATACGACCAATCAACACCTCCAGACTTATTTCCGAGCCTATCCCGGGTGTGTTGCGCATTGCGAGACATGGTCTAAGTCCTCACAAGGCGGTAGAATGACAAACATCGCCACCATTCAAGCCAATTGCCAAGCCGAGTGCAACACAATCTTTGAAATTGGTCAATAAMKFSAALLTTITATGANALWFVPPQYTTNQHLQTYFRAYPGCVAHCETWSKSSQGGRMTNIATIQANCQAECNTIFEIGQ该基因的体外表达产物按照0.5mg/ml～2.5mg/ml浓度直接接种到致伤的水稻叶片后引起水稻叶片致伤点周围产生褐色斑点。2、根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编 码产物的体外功能检测的方法，其特征是进行PCR扩增的引物序列 为P04-F: 5'-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静，李成云，朱有勇，常青，刘林，苏源，于钦亮，王云月，张悦，孔垂思，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]