一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法。本发明专利技术提供了一种检测稻瘟病菌侵染水稻后不同时间点致病相关基因表达量的方法，该方法的技术方案是：将稻瘟病菌孢子喷雾接种到水稻叶片上，取样并提取总ＲＮＡ，应用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ嵌合荧光法对稻瘟病菌致病相关基因片段进行实时荧光定量ＰＣＲ检测，记录待测样品的Ｃ（ｔ）值，根据公式计算其致病相关基因片段的表达量。采用本方法可快速准确地检测水稻接种稻瘟病菌早期不同时间段稻瘟病菌致病相关基因的表达量；分析不同致病相关基因在不同水稻品种中的表达量及其在接种后不同时间段的变化情况；分析稻瘟病菌致病相关基因的时空表达模式等。其检测结果准确、重复性好，有助于说明这些基因的功能。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法，其步骤为：　（１）液体培养稻瘟病菌并提取其菌丝体的总ＲＮＡ，并将其中的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ；　（２）将稻瘟病菌的孢子接种到水稻植株叶片上，并在接种后早期的不同时 间段２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ和１６８ｈ提取侵染组织的总ＲＮＡ并将其中的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ；　（３）选择稻瘟病菌ＭＧ０３９８２．５肌动蛋白ａｃｔｉｎ基因作为内参基因，并根据该基因和稻瘟病菌致病相关基因：ＭＧＳ０２７４．１、Ｍ ＧＳ０３３８．１和ＭＧＳ１４６０．１的ｃＤＮＡ序列，按照实时荧光定量ＰＣＲ引物原则设计特异性引物，引物如下：　＊＊＊　（４）实时荧光定量ＰＣＲ的反应体系为：采用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ⅰ嵌合荧光法进行实时荧光定量ＰＣＲ，ＰＣＲ 混合液总体积为２０μｌ，包括ｉＱ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ１０μｌ，正向引物（Ｆ）１μｌ，反向引物（Ｒ）１μｌ，ｃＤＮＡ模板或梯度稀释成不同浓度的质粒ＤＮＡ５μｌ，灭菌双蒸水３μｌ；　（５）实时荧光定量ＰＣＲ的反应 条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸２０ｓ，共４５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ；５５℃－９５℃缓慢升温，产生熔点曲线；　（６）各ｃＤＮＡ样品分别以上述引物进行定量ＰＣＲ反应得到检测样本的ＰＣＲ扩 增循环数（Ｃｔ）；并分别以看家基因及致病相关基因的Ｃｔ值计算致病相关基因相对表达水平；其计算公式为：　基因表达倍数＝２↑［－△△Ｃｔ］　△△Ｃｔ＝［Ｃｔ目的基因（未知样品）－Ｃｔ内参基因（未知样品）］－［Ｃｔ目的基因（对照样品） －Ｃｔ内参基因（对照样品）］　对照样品是任何被选做代表１倍目的基因表达量的样品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘林，李成云，朱有勇，李华，杨静，苏源，李进斌，王云月，张悦，孔垂思，于钦亮，梁飞，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]