一种新的11肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种新的１１肽，它由１１个氨基酸残基组成，其序列为异亮氨酸－天冬氨酸－苏氨酸－赖氨酸－谷氨酸－甘氨酸－异亮氨酸－亮氨酸－谷氨酰胺－酷氨酸－半胱氨酸（ＩＤＴＫＥＧＩＬＱＹＣ），本发明专利技术还公开了它具有神经营养作用和治疗神经元退行性变疾病的用途。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肽化学，特别是涉及一种新的11肽，其制备方法和用途。APP11肽是我们首次发现的一种新的多肽，迄今尚未发现有关它肽的任何报道。90年代中期曾经发现APP17肽，β-淀粉样肽前体蛋白(β-Amyloid precursor protein,APP)肽链中第319-335位的肽段具有神经营养作用，包括促进轴突生长、增加突触密度、能保护缺血引起的脑神经元损伤。本专利技术的目的是要寻找一种肽链较APP17肽短，合成较APP17肽容易的，具有神经营养作用的多肽。经过几年的研究我们最终发现了一种新的11肽，APP11肽，它不但具有神经营养作用，而且可能治疗神经元退行性变。本专利技术的APP11肽是β-淀粉样肽前体蛋白N端第63-73位肽段，由11个氨基酸残基组成，序列为异亮氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸(IDTKEGILQYC)。我们经反复研究APP N端各种不同长度的多肽片段的生物活性，最终发现并确定APP11肽具有神经营养作用。迄今为止我们的研究发现APP11肽具有如下功能1．在体外，能增加人神经母细胞瘤株SY5Y细胞胞体面积和轴突长度，促进细胞增殖和存活能力。2．改善糖尿病小鼠的学习记忆功能和海马神经元中一些重要蛋白质的表达。3．改善糖尿病小鼠坐骨神经传导速度和一些蛋白质的表达。以上结果表明APP11肽具有神经营养作用，并存在改善实验性神经元退行性变的能力。本专利技术APP11肽采用固相法合成，固相肽合成的主要思想是先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。下式表示了这个合成过程。 原料HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂)Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)NMP氮甲基吡咯烷酮DCM二氯甲烷甲醇哌啶DMAP二甲基氨基吡啶HOBT羟基苯并三唑DCC二环己基碳二亚胺TFA三氟乙酸EDT 1,2-乙二硫醇硫代苯甲醚结晶苯酚乙腈仪器多肽自动合成仪(美国ABI431A型)旋转蒸发仪(日本Yamato RE50)高效液相色谱仪(美国PE151A型)冷冻干燥机合成方法称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即0.1mmol于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的AA按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下1．氨基酸的活化(HOBt/DCC法) Fmoc保护的氨基酸 2．联接氨基酸到树脂上 3．脱去氨基酸的Fmoc保护基 4．氨基酸的活化(HOBt/DCC法)HOBt/DCC 5．偶联 新的偶联的肽-树脂重复3-5直至合成结束，得到APP11肽的肽树脂。IDTKEGILQYC-树脂350mg将肽链从树脂上切落用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到APP11肽的粗品为100mg，收率为85％。APP11肽的纯化高效液相色谱分离纯化条件色谱柱C810×100mm色谱仪ABI 151A型 美国流动相A-0.1％TFA(三氟乙酸)H2OB-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈检测波长 214nm流速 4ml/分钟洗脱梯度 20-60％B于30分钟HPLC(高效液相色谱)分析色谱柱 C184.6×150mm流动相 A-0.1％TFA(三氟乙酸) H2OB-0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈检测波长214nm流速1ML/min洗脱梯度0-60％B于30分钟分析结果见附表A．APP11肽的鉴定APP11肽AA组份分析结果见附表B．序列IDTKEGILQYC(异亮氨酸-天门冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸)以Gly(甘氨酸)做标准理论值 测定值Gly(甘氨酸)11Ile(异亮氨酸) 21.86Leu(亮氨酸)10.98Tyr(酪氨酸)11.00Lys(赖氨酸)11.00Glu(谷氨酸)12.27Thr(苏氨酸)10.95Asp(天门冬氨酸)10.98Cys(半胱氨酸) 11.2Gln(谷氨酰胺) 1注Gln(谷氨酰胺)在酸解过程中被破坏变为Glu(谷氨酸)，所以Glu(谷氨酸)为2，而Gln(谷氨酰胺)为0。AA组份分析结果显示与目的肽的组份相符，证明合成是成功的。表A APP11肽的高效液相色谱分析结果A4700色谱数据工作站日期1999.8.20时间7:52通道B样品名称APP11分析方法号分析次数10分析方法归一法峰面积 最小峰宽4 噪声 363色谱仪 检测器操作人色谱柱C184.6*1 载体名称 分 秒峰面积 峰高标记 含量 单位1 15 416851441672290BB 100.0000％合计 6851441672290 100.0000表B APP11肽的氨基酸组份分析结果0-285009/21/9917:27SAMPLE: 7AG: 101OH: 1VIAL: 1PROB-NO.:1FILE: 1 CALC-METHOD: EBT-STDTABLE:1CONC: AREANO.NAME RT HEIGHT AREAn moln9 RATIO1 Cy503H 2.20 8493913180010.000 0.0 0.03 Asp6.82 6585112838384.144551.6102.74 Thr7.52 6432712891624.009477.4101.85 Ser8.25 1315 244600.076 8.0105.06 Glu9.1614558126850469.542 1403.6100.07 Gly12.247255012837994.199315.4100.68 Ala12.98 1004 154720.054 4.8104.211 Ile17.918328821762027.790 1022.1100.412 Leu19.044440511806984.130541.9102.013 Tyr19.986025411312604.200761.1102.614 9-ABA 21.82 347 148080.055 5.7365.416 Lys23.409356513236254.203614.4101.317 NH324.724669111125206.688113.7100.121 Ars30.46 373 146810.051 8.8143.3TOTAL764490 14853572 49.147 5829.2PEAK REJ: 10000SF : 1.000SAMP-AMT: 1.000INJ-VOL : 10.001．实验方法采用国际公认的实验方法进行水迷宫实验、免疫组化染色和神经细胞培养。1)水迷宫实验动物成模后3周行水迷宫试验，每天训练2次，连续5天，第本文档来自技高网...

【技术保护点】
序列为异亮氨酸－天冬氨酸－苏氨酸－赖氨酸－谷氨酸－甘氨酸－异亮氨酸－亮氨酸－谷氨酰胺－酪氨酸－半胱氨酸的１１肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：盛树力，王蓉，姬志娟，张景艳，赵志炜，艾厚喜，孟艳，赵咏梅，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]