能够增强植物细胞中水杨酸诱导的细胞死亡并有助于抵抗真菌毒力因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇、抵抗镰刀菌属真菌和镰刀菌赤霉病的基因及包含该基因的重组构建体制造技术

申请人已经鉴定了新的DON应答孤儿基因(ENST1‑SEQ ID NO：1)及其启动子，其具有DON应答元件，其可以用于驱动FHB抗性基因的表达。申请人已经分离了来自于小麦的基因的两个变体，其与ENST1具有约94％的同源性。申请人已经表明该基因具有大于62％核苷酸序列同一性的同源物，该基因存在于节节麦、二穗短柄草、草甸羊茅、大麦和小麦中。

Plant cells can enhance the salicylic acid induced cell death and contribute to fungal virulence factors of deoxynivalenol, resistance to Fusarium fungi and Fusarium head blight gene and the gene recombinant constructs

The applicant has identified a new DON response orphan gene (ENST1 SEQ ID NO:1) and its promoter, which has DON response element, which can be used to drive expression of FHB resistance gene. Two variants of the gene derived from wheat have been isolated from the applicant and have approximately 94% homology to ENST1. The applicant has shown that the gene has a homologue greater than 62% nucleotide sequence identity in the presence of Aegilops, two, short stalked grass, meadow fescue, barley, and wheat.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】能够增强植物细胞中水杨酸诱导的细胞死亡并有助于抵抗真菌毒力因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇、抵抗镰刀菌属真菌和镰刀菌赤霉病的基因及包含该基因的重组构建体专利技术背景本专利技术涉及能够增强植物细胞中水杨酸诱导的细胞死亡，并且有助于对真菌毒力因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抗性、对镰刀菌属真菌和镰刀菌赤霉病的抗性的基因，以及包含该基因的重组构建体。本专利技术还涉及用该基因转化的植物细胞，以及植物材料，该植物材料包括含有所述转化的植物细胞的植物细胞培养物、种子和植物。酚类化合物水杨酸是植物抗病性的关键信号分子。水杨酸积累是由病原体攻击和其它应激条件诱导的(Delaney等人，1994)。水杨酸或其类似物例如苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸的外源施用在植物中诱导抗病性(White，1979；等人，1996；Lawton等人，1996)。水杨酸正调节细胞死亡(Vlot等人，2009)，并且在这样做时其抑制活体营养型(biotrophic)病原体的扩散。它是对活体营养和半活体营养型病原体如禾谷镰刀菌(F.graminearum)的防御反应的重要组成部分(Makandar等人，2012)。禾谷镰刀菌是造成经济破坏性的谷物的镰刀菌赤霉病(FHB)的致病剂；这种病原体是半活体营养型的，在死体营养阶段(其中它们以死亡的植物组织饲喂)之前有一短的活体营养阶段。这种疾病是重要的，因为它导致小粒谷物如小麦和大麦的产量损失和毒素污染。已知增强对毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的抗性可以提高对疾病的抗性。鉴于FHB的经济重要性，已经制定了几种控制策略来预防FHB流行病。然而，宿主抗性的使用被认为是控制小麦中FHB和单端孢霉烯累积的最有效的手段。DON是植物毒性的，并且对DON的抗性增强对镰刀菌和FHB疾病的抗性。US2007/0044171公开了数千种被描述为可用于改善植物的重组多核苷酸。本专利技术的目的是发现增强水杨酸诱导的免疫并且有助于对DON和FHB的抗性的新基因。
技术实现思路
申请人已经鉴定了新的DON应答性孤儿基因(ENST1-SEQIDNO：1)及其启动子，其特征在于DON应答元件，其可以用于驱动FHB抗性基因的表达。该基因的同义词是FROG(镰刀菌抗性孤儿基因)。申请人已经从小麦中分离了与ENST1具有约94％同源性的基因的两个变体(图1-SEQIDNO：26和27)。申请人已经表明该基因具有大于62％核苷酸序列同一性的同源物，该基因存在于山羊草(Aegilopstauschii)、二穗短柄草、草甸羊茅(Festucapratensis)、大麦(Hordeumvulgare)和小麦(Triticumaestivum)中(图2)。申请人已经表明在三种转基因小麦品系中ENST1的过表达(a)增强了小麦对禾谷镰刀菌定殖的抗性(图8)以及(b)延缓了FHB疾病症状的扩散(图9)。申请人已经表明在拟南芥植物中ENST1的过表达增强了水杨酸诱导的细胞死亡(图4)(对活体营养型病原体的抗性的重要组成部分)，因此可用于抗病育种。此外，该基因对DON和产生DON的镰刀菌有应答性，并且与二穗短柄草ENST1同源物的启动子具有42％的同一性的启动子已经被克隆和测序，可用于控制DON应答基因(图5和6)。申请人已经表明，与非沉默的对照植物相比，在栽培品种CM82036的小麦头部中病毒诱导的ENST1基因沉默显著增加了DON漂白(bleached)的小穗的数量(图7)。本专利技术提供分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括SEQIDNO：1，或与SEQIDNO：1具有至少60％序列同一性的其功能变体(下文称为“本专利技术的多核苷酸”)。本专利技术还提供由本专利技术的分离的多核苷酸编码的分离的蛋白质(下文称为“本专利技术的蛋白质”)。本专利技术还提供包括在植物细胞中发挥作用的可操作连接到转基因的启动子区的重组构建体，其中该转基因包括本专利技术的多核苷酸。优选地，该启动子区包括DON应答启动子，优选SEQIDNO：2的序列，或其与SEQIDNO：2具有至少40％序列同一性的功能变体。本专利技术还提供包括本专利技术的重组构建体的转化平台。优选地，启动子区包括DON应答启动子。优选地，所述启动子区包括SEQIDNO：2的序列。优选地，所述转基因包括SEQIDNO：1的重组多核苷酸。最优选地，所述启动子区包括SEQIDNO：2的序列，并且所述转基因包括SEQIDNO：1的重组多核苷酸。典型地，所述转化平台包括能够介导细胞转化或基因枪转化的细菌。本专利技术还提供用本专利技术的多核苷酸、重组构建体或转化平台遗传转化的植物材料。典型地，所述植物材料选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。典型地，所述转化的植物材料包括能够过表达本专利技术的多核苷酸的转化细胞。本专利技术还提供包括携带转基因的植物细胞的植物材料，其中所述转基因包括本专利技术的多核苷酸。本专利技术还提供遗传转化植物材料的方法，该方法包括用本专利技术的多核苷酸、重组构建体或转化平台转化植物材料的细胞或多个细胞的步骤，其中转化的细胞或多个细胞通常能够过表达本专利技术的多核苷酸。典型地，所述植物材料选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。本专利技术还提供产生转基因细胞的方法，该方法包括以下步骤：用包括本专利技术的重组构建体的转化平台接种细胞，在使得转化平台能够转化细胞的条件下培养该细胞，选择性地筛选接种细胞用于转化的细胞，并且通常分离该转化的细胞或每个转化的细胞。优选地，所述重组构建体包括DON应答启动子。最优选地，所述重组构建体包括启动子区和转基因，该启动子区包括SEQIDNO：2的序列，转基因包括SEQIDNO：1的重组多核苷酸。本专利技术还提供产生转基因植物的方法，该方法包括根据本专利技术的方法产生转基因细胞，并从转化的细胞产生转化植物的步骤。本专利技术还提供产生具有改善性质的植物的方法，该方法包括以下步骤：用根据本专利技术的转化平台或包括本专利技术的重组构建体的转化平台转化植物，并种植所述植物。优选地，所述重组构建体包括DON应答启动子。最优选地，所述重组构建体包括启动子区和转基因，该启动子区包括SEQIDNO：2的序列，转基因包括SEQIDNO：1的重组多核苷酸。典型地，所述改善性质选自于：对FHB疾病的抗性、对DON的抗性、提高产量、提高种子数量、提高种子重量、改善的抗病性。优选地，所述植物是谷物植物，优选小粒谷物植物。理想地，所述植物选自于小麦、大麦、燕麦、玉米或拟南芥植物。本专利技术还提供根据本专利技术的方法遗传转化的植物材料，其中该植物材料的至少一个细胞过表达本专利技术的重组多核苷酸。典型地，所述植物材料选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。本专利技术还涉及能够介导细胞转化并含有根据本专利技术的转化平台的细菌。本专利技术还涉及根据本专利技术的方法产生的种子、转基因细胞、植物细胞培养物或植物细胞、转基因植物组织、转基因植物材料或稳定的转基因植物。本专利技术还涉及含有本专利技术的转化平台或重组构建体或重组多核苷酸的种子、转基因细胞、植物细胞培养物或植物细胞、转基因植物组织、转基因植物材料或稳定的转基因植物。本专利技术还涉及能够遗传转化细胞(理想地，植物细胞)的试剂盒，其包括(a)能够介导细胞转化的细菌，(b)重组构建体，和(c)转基因。所述转基因可以位于单一转化载体上或可以位于不同的载体上本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组构建体，其包含在植物细胞中作用的可操作连接到转基因的启动子区，其中所述转基因包括SEQ ID NO：1的分离的多核苷酸，或其与SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性的功能变体，并且其中所述启动子区包括DON应答启动子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.15 EP 14177179.01.重组构建体，其包含在植物细胞中作用的可操作连接到转基因的启动子区，其中所述转基因包括SEQIDNO：1的分离的多核苷酸，或其与SEQIDNO：1具有至少60％序列同一性的功能变体，并且其中所述启动子区包括DON应答启动子。2.如权利要求1所述的重组构建体，其中所述功能变体与SEQIDNO：1具有至少70％的序列同一性。3.如权利要求1所述的重组构建体，其中所述功能变体与SEQIDNO：1具有至少80％的序列同一性。4.如权利要求1所述的重组构建体，其中所述功能变体与SEQIDNO：1具有至少90％的序列同一性。5.如前述权利要求中任一项所述的重组构建体，其中所述启动子区包括SEQIDNO：2的序列，或其与SEQIDNO：2具有至少40％序列同一性的功能变体。6.如权利要求1-4中任一项所述的重组构建体，其中所述启动子区包括SEQIDNO：2的序列，或其与SEQIDNO：2具有至少90％序列同一性的功能变体。7.转化平台，其包括能够介导细胞转化的生物体并且包含权利要求1-6中任一项所述的重组构建体。8.如权利要求7所述的转化平台，其中所述生物体是细菌。9.如权利要求7或8所述的转化平台，其中所述启动子区包括SEQIDNO：2的序列，并且所述转基因包括SEQIDNO：1的重组多核苷酸。10.植物材料，该植物材料用权利要求1-6中任一项所述的重组构建体遗传转化。11.如权利要求10所述的植物材料，其选自于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物和转基因植物种子。12.遗传转化植物材料的方法，包括用权...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·杜安，G·埃拉尔，A·佩罗雄，K·安萨里，C·阿伦纳查拉姆，J·卡茨普尔齐克，
申请(专利权)人：爱尔兰国立都柏林大学，
类型：发明
国别省市：爱尔兰,IE