超支化阳离子聚合物作为转染细胞的核酸递送载体制造技术

描述了超支化阳离子聚合物。所述聚合物采用4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】超支化阳离子聚合物作为转染细胞的核酸递送载体


[0001]本专利技术涉及超支化聚合物。还设想了包含与核酸复合的超支化聚合物的组合物，以及所述组合物用于转染细胞的用途。

技术介绍

[0002]经过近三十年的发展，基因疗法已经成为快速增长的纳米医学方案的主要部分，用于改善健康状况和纠正遗传病症。尽管已经使用病毒基因递送载体开展了多项临床试验，但引发免疫原性反应和转基因插入诱变的风险、与大规模生产相关的限制和较低的遗传材料“载货能力”，以及载体移动性的不可预测性仍然未得到解决。历史上唯一获批的基因疗法是Glybera，这是一种用于逆转脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPDL)的病毒基因疗法。这种疗法已经获得EMA的批准，但FDA要求开展uniQure无法完成的更多长期研究。由于每次100万的治疗成本，因此该产品最终无法推向市场。
[0003]从这个角度来看，非病毒基因递送载体的前景将更好，因为它们具有非常低的免疫原性、非致瘤性、成本效益高、核酸载荷高和局部基因表达的潜力。最常见的非病毒方法包括昂贵的物理方法，例如基因枪、电穿孔和注射以及相对低效且有毒的化学制剂。转染效率，例如，采用不同的电穿孔系统检测，人真皮成纤维细胞和人原代成纤维细胞中的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的递送效率分别只有27％和44％。领先的阳离子脂质试剂TransFectin、Lipofectanmmine LTX和电穿孔在小鼠胚胎成纤维细胞中的最大转染效率分别是15.7％、11.8％和48.1％。而且，除了昂贵之外，那些物理方法无法在体内开展，仅限于体外使用，因此它们的使用确实受到限制。
[0004]阳离子脂质体DNA复合物(脂质体复合物(lipoplexes))是研究最普遍的非病毒系统，但是，人们发现阳离子聚合物DNA复合物(聚合复合物(polyplexes))更稳定。与病毒相比，阳离子聚合物易合成、功能多样且安全性更高，是一种很有吸引力的替代品。非病毒载体可以通过静电相互作用将核酸凝聚成纳米粒子，保护它们免受酶降解，并以有效和细胞相容的方式促进穿过细胞膜转运。由于转染效率低和转基因表达差，到目前为止，基于聚合物的非病毒基因递送系统的临床转化一直受到限制。第一次使用聚合物进行基因疗法的临床试验可以追溯到2010年，当时采用环糊精递送siRNA用于癌症治疗。在基于聚合物的基因疗法选择中，一些临床试验，例如现成的阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)，已显示出一些前景。然而，PEI无法降解，并且受到其安全问题的严重阻碍。从那时起，许多基于聚合物，主要使用PEI衍生物的临床试验一直未开展，由于未能达到其主要终点，因此没有一个获得FDA批准(Davis,2009,Chen et al.,2016)。尽管这种明显的失败，但其表明基于聚合物的基因疗法的临床转化只是在等待开发出有效的递送载体。
[0005]线性聚(β
‑
氨基酯)(LPAE)已成为最通用的基因传递载体之一。自2000年Lynn和Langer首次开发以来LPAE，Green等人和Anderson等人已经设计、合成和筛选了2500多种LPAE。性能最佳的C32系列已被鉴定用于体外和体内基因递送，甚至可以与人脐静脉内皮细胞腺病毒递送相媲美。到目前为止，大多数聚(β
‑
氨基酯)的设计、合成和转染研究都集中在
它们的线性结构上。尽管LPAE的结果非常令人鼓舞，但合成和优化具有多个官能团的结构的潜力受到这些聚合物线性性质的限制。
[0006]WO2016/020474描述了由以下步骤形成高度支化的聚(β
‑
氨基酯)：使3
‑
支化三丙烯酸酯组分、二丙烯酸酯组分和伯胺组分一起反应形成聚合物，然后使聚合物与伯胺或仲胺封端单体反应提供高度支化的阳离子聚合物。据发现，与线性聚(β
‑
氨基酯)相比，这种聚合物的基因转染效率增强。US2017/209597描述了使用至少一种四官能非离子两亲嵌段共聚物作为戴帽或未戴帽mRNA的载体，用于基因疗法的细胞内递送。US2003/215395描述了一种可控降解的阳离子聚合物，用于递送医学成像应用中使用的生物分子(核酸、肽等)、药物、分子，癌症治疗中使用的敏化剂和组织工程中使用的分子。
[0007]本专利技术的一个目的是克服上面提到的至少一个问题。

技术实现思路

[0008]本申请人提供一种高度支化的阳离子聚合物，所述聚合物采用4
‑
支化单体，由于额外的支化单元，导致官能末端基团数量增加，从而在不同细胞类型(包括aADSC、HeLa、Neu7和RDEB角质形成细胞)中提供出色的转染效率和细胞相容性，并提供不同的基因治疗方法，例如GFP质粒DNA和用于COL7A1外显子80跳跃的核糖核蛋白CRISP
‑
Cas 9复合物。此外，本专利技术聚合物的额外支化单元增加了聚合物上的正电荷，改善了细胞内内体逃逸。如本文所述，4
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支化单元可以是二胺组分或四丙烯酸酯组分，尽管可以使用其他4
‑
支化单体，例如具有四丙烯酰胺基团(即4
‑
臂PEG丙烯酰胺、4
‑
臂PEG马来酰亚胺)的任何组分、具有四
‑
N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团(即4
‑
臂PEG
‑
琥珀酰亚胺碳酸酯NHS酯)的任何组分、任何类型的四硫醇组分(即季戊四醇四(3
‑
巯基丙酸酯)、4
‑
臂PEG
‑
硫醇、四(2
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巯基乙基)硅烷)和任何四环氧组分(即四缩水甘油基亚甲基二苯胺、四缩水甘油基1,1'
‑
亚甲基双(萘
‑
2,7
‑
二醇)、季戊四醇四缩水甘油醚、4
‑
臂聚乙二醇环氧化物)。
[0009]在第一方面，本专利技术提供一种通过将以下组分一起反应来制备的聚合物：
[0010](i)具有四个可以与丙烯酸酯或胺基反应的反应位点的四支化单体；
[0011](ii)通常具有式(I)的二丙烯酸酯组分，
[0012][0013]其中Z2是1至30个碳原子的直链或支链碳链、含杂原子的1至30个原子的直链或支链碳链、含3至30个碳原子的碳环或含3至30个原子的杂环；
[0014]其中Z2未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基(sulphonamide group)、硫醇、C1
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C6烷基、C1
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C6烷氧基、C1
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C6醚、C1
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C6硫醚、C1
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C6砜、C1
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C6亚砜、C1
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C6伯酰胺、C1
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C6仲酰胺、卤代C1
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C5烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、
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OC(0)NR'R'、
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N(R')C(0)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种超支化聚合物，其通过将以下组分一起反应来制备：(i)四支化单体；(ii)式(I)的二丙烯酸酯组分其中Z2是1至30个碳原子的直链或支链碳链、含杂原子的1至30个原子的直链或支链碳链、含3至30个碳原子的碳环或含3至30个原子的杂环；其中Z2未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、硫醇、C1
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C6烷基、C1
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C6烷氧基、C1
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C6醚、C1
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C6硫醚、C1
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C6砜、C1
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C6亚砜、C1
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C6伯酰胺、C1
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C6仲酰胺、卤代C1
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C5烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、
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OC(0)NR'R'、
‑
N(R')C(0)NR'R、
‑
N(R')C(0)0
‑
C1
‑
C6烷基、C3
‑
C6环烷基、C3
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C6杂环基、C2
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C5杂芳基和C6
‑
C10芳基中的至少一种取代；其中每个R'独立地选自由氢和C1
‑
C6烷基组成的组；(iii)包含3至20个原子的第一胺组分，其中所述胺组分未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、硫醇、C1
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C6烷基、C1
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C6烷氧基、C1
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C6醚、C1
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C6硫醚、C1
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C6砜、C1
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C6亚砜、C1
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C6伯酰胺、C1
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C6仲酰胺、卤代C1
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C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、
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OC(0)NR'R'、
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N(R')C(0)NR'R、
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N(R')C(0)0
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C1
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C6烷基、C3
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C6环烷基、C3
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C6杂环基、C2
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C5杂芳基和C6
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C10芳基中的至少一种取代；其中每个R'独立地选自由氢和C1
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C6烷基组成的组；和(iv)包含3至20个原子的第二胺组分，其中所述胺组分未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、硫醇、C1
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C6烷基、C1
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C6烷氧基、C1
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C6醚、C1
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C6硫醚、C1
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C6砜、C1
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C6亚砜、C1
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C6伯酰胺、C1
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C6仲酰胺、卤代C1
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C6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、
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OC(0)NR'R'、
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N(R')C(0)NR'R、
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N(R')C(0)0
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C1
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C6烷基、C3
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C6环烷基、C3
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C6杂环基、C2
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C5杂芳基和C6
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C10芳基中的至少一种取代；其中每个R'独立地选自由氢和C1
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C6烷基组成的组。2.根据权利要求1所述的超支化聚合物，其中所述二丙烯酸酯和第一胺组分一起反应形成第一低聚物，第一低聚物和第二胺组分一起反应形成第二低聚物，第二低聚物和四支化单体一起反应形成所述超支化聚合物。3.根据权利要求1所述的超支化聚合物，其中所述四支化单体、二丙烯酸酯组分和第一胺组分在迈克尔加成反应中一起反应形成第一聚合物，第一聚合物和第二胺组分在迈克尔加成反应中一起反应形成所述超支化聚合物。4.根据前述权利要求中任一项所述的超支化聚合物，其中所述四支化单体选自二胺组分、四丙烯酸酯组分、四丙烯酰胺组分、四硫醇组分、四环氧组分和四取代硅烷。5.根据权利要求4所述的超支化聚合物，其中所述四支化单体选自由以下项组成的组：
6.根据前述权利要求中任一项所述的超支化聚合物，其中式(I)的二丙烯酸酯组分选自7.根据前述权利要求中任一项所述的超支化聚合物，其中所述第一胺组分选自：
8.根据前述权利要求中任一项所述的超支化聚合物，其中所述第二胺组分是具有结构NH2‑
L4‑
NH2的二胺组分或选自：
9.根据前述权利要求中任一项所述的超支化聚合物，其中所述第二胺组分选自：
10.一种聚合复合组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的超支化聚合物和复合在一起的核酸组分。11.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文新，阿斯根，I，
申请(专利权)人：爱尔兰国立都柏林大学，
类型：发明
国别省市：