用于基因疗法的纳米粒子组合物制造技术

一种纳米颗粒组合物，其包含复合在阳离子聚合物中的基因编辑核糖核蛋白系统。所述阳离子聚合物可以是聚

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因疗法的纳米粒子组合物


[0001]本专利技术涉及用于基因疗法的纳米颗粒组合物。还设想了治疗皮肤遗传病症(例如隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB))的方法。

技术介绍

[0002]隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)目前除了姑息治疗外，尚未有临床疗法，因此非常需要一种通过使患者自身细胞表达VII型胶原从而恢复皮肤结构完整性的疗法。我们研究小组的专长在于设计将核酸引入到细胞和组织中的新方法。目前恢复VII型胶原表达的核酸治疗方法存在将治疗递送至细胞和组织的安全性和有效性问题。基因组编辑是一种对细胞的DNA进行特定改变的方法，可用于通过修复引起疾病的突变来治疗RDEB等病症。先前的基因组编辑技术(ZFN和TALEN)已经被用于RDEB的治疗方法。近年来，一种更安全、更通用的新的基因组编辑技术(CRISPR)因其对遗传疾病患者的高治疗潜力而引起了人们的极大兴趣。
[0003]因此，开发安全高效的递送系统对于CRISPR基因组编辑在临床中的成功非常重要。尽管潜力巨大，但克服有效递送的障碍对于实现安全有效的临床成功仍然很关键。目前将CRISPR递送到细胞中的方法是通过；(1)病毒载体；(2)细胞电穿孔；或(3)聚合物载体。通过非病毒递送瞬时表达治疗性Cas9和向导RNA避免了Cas9持续表达引起的免疫反应，并减少了体内的脱靶效应。在CRISPR系统方法中，可以以温和的方式使用的安全的非病毒聚合物递送载体，矫正了RDEB患者的VII型胶原，避免了与这种使人衰弱的病症相关的大量并发症和侵入性程序。
>[0004]O'Keefe Ahern等人(Journal of Investigative Dermatology Vol.138,No.5.19May 2018,pages S141
‑
S141)描述了通过非病毒聚合物递送系统，特别是以静电方式与带负电荷的核酸(质粒DNA)结合的高度支化聚(β
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氨基酯)聚合物，将基于CRISPR/Cas9的COL7A1基因组编辑应用于治疗隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)。
[0005]Zeng等人(Nano Letters,Vol.19,No.1,19December 2018,pages 381
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391)描述了包含DNA和聚(β
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氨基酯)聚合物的颗粒及其在成纤维细胞基因转染(质粒DNA)中的用途。
[0006]Zeng等人(ACS APPLIED MATERIALS&INTERFACES,Vol.11,No.34,28August 2019,pages 30661
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30672)描述了包含微环COL7A1 DNA和支化聚(β
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氨基)酯的纳米粒子。
[0007]WO2019/104058描述了使用具有由磷脂双层包裹的聚(β
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氨基酯)核的核壳结构纳米粒子递送核酸，包括核糖核蛋白。
[0008]Kang等人(Bioconjugate Chem 2017,28,957
‑
967)描述了使用纳米级CRISPR复合物的非病毒基因组编辑，所述复合物包含与Cas9蛋白共价结合的PEI，其然后与单
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向导RNA分子复合。
[0009]Chen等人(ACS APPLIED MATERIALS&INTERFACES,2018,10,18515
‑
18523)描述了在核酸(DNA、RNA或Cas9/sgRNA核糖核蛋白)和阳离子聚合物聚(天冬氨酸
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(2
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氨基乙基二硫化物)
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(4
‑
咪唑羧酸))
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聚(乙二醇)之间形成的聚合复合物(polyplexes)。
[0010]Wang等人(ACS APPLIED MATERIALS&INTERFACES,2018,10,31915
‑
31927)描述了在核酸(DNA、RNA或Cas9/sgRNA核糖核蛋白)和阳离子共聚物聚(N'N'
‑
双(丙烯酰基)胱胺
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共
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三亚乙基四胺)之间形成的聚合复合物。
[0011]本专利技术的目的是克服上面提到的至少一个问题。

技术实现思路

[0012]本申请人已经发现，超支化聚(β
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氨基)酯聚合物能够有效地将核糖核蛋白复合物缩合成纳米粒子，保护它们免于酶降解及促进其以有效且细胞相容(cytocompatible)的方式穿过细胞膜转运。已经表明，本专利技术的包含功能性CRISPR
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Cas9 VII型胶原外显子80切除系统的纳米颗粒组合物，能够以高的转染效率和矫正效率以及高细胞活力转染角质形成细胞(图5至7)。在体内局部和皮下注射2天后，这些组合物能够通过隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)的水疱穿透表皮基底层(图9)，在局部施用该组合物7天后，能够在体内和体外切除外显子80(图10)，并在体内恢复VII型胶原(图11)。与CRISPR
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质粒系统相比，本专利技术的纳米颗粒组合物表现出更高的转染效率(图12)和更高的矫正效率(8.2％至43.2％
‑
图13)。本专利技术广泛涉及包含疏水性阳离子聚合物和CRISPR
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Cas衍生物的核糖核蛋白复合物的纳米颗粒组合物、它们在基因疗法(尤其是皮肤遗传病症)中的用途，特别是用于治疗RDEB。
[0013]在第一方面，本专利技术提供包含复合在阳离子聚合物(例如超支化聚合物)中的基因编辑核糖核蛋白系统的纳米颗粒组合物(下文称为“纳米颗粒组合物”或“核糖聚合复合物”)。
[0014]在一个实施例中，超支化聚合物是聚(β氨基酯)超支化聚合物。
[0015]在一个实施例中，超支化聚合物是3
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支化超支化聚合物或4
‑
支化超支化聚合物。
[0016]在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统是Cas9
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gRNA核糖核蛋白系统，例如CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统，其通常配置为诱导靶基因组序列的删除，包括切除基因中的突变或外显子、替换基因突变或产生基因敲低或敲除。可用于本专利技术的其他基因编辑核糖核蛋白系统包括例如替代的CRISPR
‑
Cas衍生物，例如Cas12a、Cas14、CRISPR碱基编辑器、锌指核酸酶系统和TALEN系统。
[0017]在一个优选的实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统是CRISPR
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Cas9基因编辑系统。
[0018]在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统配置用于外显子切除。在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统是CRISPR
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Cas9基因编辑系统。在一个实施例中，基因编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种纳米颗粒组合物，其包含复合在聚
‑
β氨基酯超支化聚合物中的基因编辑核糖核蛋白系统。2.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述超支化聚合物是3
‑
支化聚
‑
β氨基酯超支化聚合物或4
‑
支化聚
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β氨基酯超支化聚合物。3.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述超支化聚合物是4
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支化聚
‑
β氨基酯超支化聚合物。4.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述基因编辑核糖核蛋白系统是CRISPR
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Cas基因编辑系统，其配置为切除基因中的突变或外显子、替换基因中的突变或产生基因敲低或敲除。5.根据权利要求4所述的纳米颗粒组合物，其中所述基因编辑核糖核蛋白系统是CRISPR
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Cas9基因编辑系统，其配置为切除编码VII型胶原蛋白的COL7A1基因的外显子80。6.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，其平均尺寸是100nm至300nm。7.一种偶联物，其包含前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物，和(a)配置为将所述纳米颗粒组合物靶向至特定靶细胞或组织类型的靶向配体或(b)成像标记。8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的纳米颗粒组合物或根据权利要求7所述的偶联物以及合适的药物赋形剂。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其配制为局部施用至皮肤或皮下注射至皮肤内。10.一种制备纳米颗粒组合物的方法，包括以下步骤：提供在缓冲液中的基因编辑核糖核蛋白系统的溶液；提供在合适的非水溶剂中的阳离子聚合物的溶液；混合这些溶液，使得混合物中阳离子聚合物的质量相对基因编辑核糖核蛋白系统的质量是过量的；和静置混合物，使得形成纳米颗粒组合物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述阳离子聚合物是聚
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β氨基酯超支化聚合物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述超支化聚合物是3
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支化聚
‑
β氨基酯超支化聚合物或4
‑
支化聚
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β氨基酯超支化聚合物。13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物溶液通过将所述阳离子聚合物溶解在DMSO中，然后将所述溶液在水性缓冲液中稀释而制备。14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物以10至200mg/ml的浓度溶解在所述溶剂中。15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中用缓冲液稀释后的阳离子聚合物溶液包含0.1至100g阳离子聚合物。16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述基因编辑核糖核蛋白系...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文新，阿斯根，I，
申请(专利权)人：爱尔兰国立都柏林大学，
类型：发明
国别省市：