干扰素和免疫球蛋白Fc片段杂合体制造技术

本发明专利技术提供用于消除或消退肿瘤或延迟肿瘤发展的干扰素－免疫球蛋白Ｆｃ融合蛋白（″ＩＦＮ－Ｆｃ杂合体″）。ＩＦＮ－Ｆｃ杂合体较佳包括在ＩＦＮ及Ｆｃ片段之间的肽连接体。此等连接体为Ｔ细胞惰性序列或任何非免疫原序列，较佳为Ｇｌｙ－Ｓｅｒ重复单位。较佳Ｆｃ片段为人类免疫球蛋白Ｆｃ片段，较佳为γ４链。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有一与一免疫球蛋白Fc片段共价连接的干扰素蛋白的蛋白质杂合体，其包括具有连接干扰素蛋白和免疫球蛋白Fc片段的肽连接体的杂合体。
技术介绍
干扰素，包括干扰素-α(″IFNα″)及干扰素-β(″IFNβ″)，其属于第一批通过重组DNA技术生产的细胞因子。经证明IFNα对例如发状细胞白血病和炎症及病毒性疾病(包括B型肝炎)等病症具有治疗价值。已批准IFNβ用于治疗多发性硬化症。包括IFNα在内的大多数细胞因子具有相当短的循环半衰期，其原因是其在体内产生，仅局部起作用且作用时间短暂。为将IFNα用作一种有效的系统治疗药物，需要相当大的剂量及频繁投药。如此频繁投药很不方便且很疼痛。另外，与施与IFNα相关的毒性副作用相当严重，以致某些癌症患者不能忍受这种治疗。这些副作用很可能与高剂量投药有关。为克服这些缺点，可修饰该分子以增加其循环半衰期或修饰该分子的调配物以延长其释放时间。于是可减少剂量和降低投药频率，从而提高效力。人们已努力建构一具有延长保留时间的重组IFNα-明胶杂合体(Tabata，Y.等人，Cancer Res.515532-8，1991)。亦将一种脂质包胶IFNα调配物在动物体内进行试验，且在腹膜内实现蛋白质的延长释放(Bonerti，A.及kim，S.CancerChemother Pharmacol.33258-261，1993)。IgG及IgM免疫球蛋白属于人体血液中最丰富的蛋白质。它们的循环半衰期在7天到2 1天范围内。已发现当IgG用于形成重组杂合体时可增加几种配体结合蛋白质(受体)的半衰期，这些受体包括可溶性CD4分子、LHR及IFN-γ受体(Mordenti J.等人，Nature，337525-31，1989；Capon，D.J.及Lasky，L.A.，美国专利第5,116,964号；Kurschner，C.等人，J.Immunol.1494096-4100，1992)。已证明，多种连接体皆对产生蛋白质杂合体有用。1998年3月3日颁予Chang等人的美国专利第5,723,125号(名称为″通过一非免疫原肽连接在一起的干扰素-α和免疫素蛋白Fc杂合体(Hybrid with interferon-alpha and animmunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide)″)及1999年6月1日颁予Chang等人的美国专利第5,908,626号(名称为″通过一肽连接体连接在一起的干扰素-β和免疫素蛋白Fc杂合体(Hybrid with interferon-.beta.and an immunoglobulin Fc joined by a peptide linker)″，)揭示由通过一包含序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser的肽连接体将人类干扰素及人类免疫球蛋白Fc片段连接在一起组成的杂合重组蛋白质。考虑到使用干扰素治疗患者所存在的问题，有必要改进将干扰素施予患者的组合物及方法，同时延长体内半衰期并减少不利的副作用。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目标是提供其体内半衰期长于干扰素的干扰素杂合体。本专利技术的另一目标是提供其投药频率低于干扰素的干扰素杂合体。本专利技术的再一目标是提供可有效消除或消退肿瘤或延迟肿瘤发展的干扰素杂合体。通过使用一包含一其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体或一包含一其C-末端共价连接到一肽连接体(该肽连接体的C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端)的N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体，可实现这些及其他目标。较佳连接体为一由具有大约2到大约40个氨基酸的Gly Ser重复单位组成的免疫惰性肽。连接体也可为T细胞惰性氨基酸序列或任何非免疫原氨基酸序列。本专利技术的杂合体可有效治疗肿瘤患者以消除肿瘤、消退肿瘤或延迟肿瘤发展。所属领域的技术人员将容易地了解本专利技术的其他及更多的目标、特点及优点。序列表概述SEQ ID NO1为一IFN-α-Fc杂合体的核苷酸及氨基酸序列。SEQ ID NO2为SEQ ID NO1中所示的一IFN-α-Fc杂合体的氨基酸序列。SEQ ID NOS3-9为用于将一重链γ4 Fc片段的N-末端结合到一IFN-β蛋白质的C-末端的各种长度肽连接体的氨基酸序列。SEQ ID NO10为一用于将一重链γ1 Fc片段的N-末端结合到一下述测试法所用IFN-α蛋白质的C-末端的连接体的氨基酸序列。SEQ ID NO11为一用于将一重链γ4 Fc片段的N-末端结合到一IFN-α蛋白质(其分子后来用于下述体外细胞病变效应分析中)的C-末端的连接体的氨基酸序列。附图说明图1所示为对一IFN-β-Fc杂合体中各种连接体的病毒诱导细胞病变效应抑制作用分析。图2所示为对一IFN-α-Fc杂合体中两种不同连接体的病毒诱导细胞病变效应抑制作用分析。具体实施例方式本专利技术提供一包含一其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体。该干扰素蛋白可以是任一种包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω、干扰素-δ及干扰素-τ在内的I型干扰素或包括干扰素-γ在内的II型干扰素。较佳地，该干扰素蛋白为一干扰素-α或干扰素-β，最佳地为一干扰素-α2a或干扰素-α2b。该免疫球蛋白Fc片段可以是来自包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM在内的任一类免疫球蛋白的一个片段。较佳地，该Fc片段为一人类免疫球蛋白Fc片段，最佳为一IgG4(γ4)亚类的IgG Fc片段。γ4链优于γ1链，因为前者经证明具有很少或不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体激活能力，且在人体循环中很稳定。本专利技术亦提供一蛋白质杂合体同型二聚体，其包含两个其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段(较佳地为一γ4 Fc片段)的两个N-末端中每一个的干扰素蛋白。本专利技术亦提供一包含一以其C-末端共价连接到一肽连接体(其C-末端共价连接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端)N-末端的干扰素蛋白的蛋白质杂合体。干扰素蛋白与Fc片段通过一T细胞免疫惰性肽连接，较佳通过具有Gly Ser重复单位的肽连接。因为这些肽为免疫惰性，所以在融合点插入这些肽可消除任何当直接将干扰素和Fc片段连接在一起时可能会出现的新抗原性。肽连接体较佳地为由具有约2到约40个氨基酸的Gly Ser重复单位组成的免疫惰性肽。该些肽连接体的典型氨基酸序列示于SEQ ID NOS 3、4、5、6、7、8及9中。此等连接体具有连接干扰素和Fc片段而不对干扰素的生物活性产生显著不良影响的独特能力。尽管在本专利技术中所有长度的连接体皆有效，但某些连接体比另一些略微有效一些，即具12或更多个氨基酸的连接体比短一些的连接体活性略微大一些。较佳地，肽连接体具有12到15个氨基酸或约17到40个氨基酸。不含连接体的IFNα-Fc杂合体的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO1中，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO2中。如果存在连接体，则其位于第188(Glu)和189(Glu)位氨基酸残基之间。所有经证明在体外具有大约相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质杂合体，其包含一共价连接到一免疫球蛋白Ｆｃ片段的干扰素蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张榭文，余利明，
申请(专利权)人：唐纳士公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]