用于鉴定FC受体多态性的核酸分析方法技术

本发明专利技术提供了Ｆｃγ　　ＲⅢ多态性的特异性寡核苷酸。本发明专利技术还提供了以核酸为基础的基因分型方法，该方法利用本文所描述的寡核苷酸作为扩增和／或测序引物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及基因分型领域。具体地说，本专利技术涉及用于精确而有效地确定个体FcγRIII基因型的核酸分析方法。
技术介绍
IgG受体(FcγR)是在中性粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和其他类型的细胞表面表达的膜结合糖蛋白。例如，现已证实FcγRIIIHA(CD16)参与各种生理过程，如吞噬作用、内吞作用、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、炎症介质的释放以及抗原呈递的增强。Van de Winkel等，(1993)Immunol Today 14(5)215-21。与NK细胞表面表达的低亲和性FcγRIIIA受体结合的IgG被认为是导致ADCC的基本机制。见Clynes等，(2000)Nature Med.6443-446；Cooper等，(2001)Trends Immunol.22633-640；Leibson(1997)Immunity 6655-661；Roitt等，(2001)Immunology(第6版，Mosby，Edinburgh，UK)。两个FcγRIII基因，FcγRIIIa(A基因)和FcγRIIIb(B基因)已被鉴定出来。Ravetch和Perussia(1989)J.Exp Med 170481。FcγRIII受体已被定位于1号染色体的长臂。Van de Winkel等，(1993)Immunol Today 14(5)215-21。另外，现已确定FcγRIIIA有多种功能多态性，其中包括FcγRIIIa的双等位基因功能多态性(559位核苷酸由G→T)，这预示着在158位氨基酸上缬氨酸(V)替代成苯丙氨酸(F)。Koene等，(1997)Blood901109-1114。试验证明FcγRIIIA 158V等位基因与人IgG1的结合要优于158F等位基因，158V等位基因结合能力的升高可增强效应细胞的活化，产生更强的ADCC。Shields等，(2001)J.Biol.Chem.1766591-6604；Vance等，(1993)J.Immunol.1516429-6439。试验证实，治疗效果也受158V/F多态性的影响-FcγRIIIa 158F/F纯合子对治疗性抗体如ritubimab的反应性下降。Cartron等，(2002)Blood99754-758；Weng和Levy(2003)J.Clin.Oncol.211-8。由于FcγRIIIA 158V/F多态性具有功能及临床方面的潜在应用价值，因此，已有多个研究小组设计出对特定个体进行基因分型的PCR方法。见Koene等，(1997)Blood90(3)1109-1114；Lepperts等，(2000)J.Immuno Methods 242127-132；Jiang等，(1996)J.Immunol.Methods 19955-59；Morgan等，(2003)Rheumatology 42528-533；Dall′Ozzo等，(2003)J.Immunol.Methods 277185-192；以及美国专利Nos.5,830,652和5,985,561。然而，现有的分析方法在确定多态性时误差率至少也有10％，另外，也不能有效地或精确地区分FcγRIIIA(A基因)和FcγRIIIB(B基因)。因此，现在依然需要开发出能用于精确而有效地确定受试者FcγIII基因型的组合物和方法。专利技术概述本专利技术的基础在于开发出灵敏而可靠的核酸检测方法来确定任何样品的FcγRIII基因型。在本专利技术的一个方面，本专利技术包括分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包含长度为10到60个核苷酸的核苷酸序列，其中的核苷酸序列包含(a)选自SEQ ID NO1-19的序列；(b)与(a)的核苷酸序列有80％序列相同性的核苷酸序列；或(c)(a)和(b)的互补序列。本文所描述的任何分离的核苷酸还可以含有可检测标记，如荧光标记(如6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和/或2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET))。在另一个方面，本专利技术描述的是确定受试者FcγRIII基因型的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)利用包含至少一种本文所述寡核苷酸(如SEQ ID NO1-19)的至少第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸；以及(c)检测利用每一种寡核苷酸组合扩增后是否存在扩增的核酸，其中是否存在扩增的寡核苷酸预示着受试者的FcγRIII的基因型。在某些实施方式中，至少有一种寡核苷酸是FcγRIII多态性特异性的。另外，在其他的实施方式中，至少有一种寡核苷酸对于至少一种FcγRIII多态性是通用的。在本文所描述的所有方法中，寡核苷酸的其他组合都可用于从样品中扩增核酸，如利用再一种其它寡核苷酸引物组合通过重复进行步骤(b)和(c)来扩增。在某些实施方式中，寡核苷酸的第一和第二组合都包含一种通用引物。在本文所描述的所有方法中，FcγRIIIa第158V/F位的基因型都可以确定。因此在某些实施方式中，寡核苷酸引物的第一组合包含SEQ ID NO5和SEQ ID NO2，寡核苷酸引物的第二组合包含SEQ ID NO5和SEQ ED NO1。在利用这些引物组合的方法中，利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增存在扩增产物但是利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增不存在扩增产物说明是158VV基因型；利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增不存在扩增产物但是利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增存在扩增产物说明是158FF基因型；以及利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增存在扩增产物并且利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增也存在扩增产物说明是158FV基因型。另外，在本文所描述的所有方法中，受试者其他核苷酸位置上的FcRIII基因型也可以被确定，例如选自位置121、153、179、207、313及其组合的核苷酸位置。本文所描述的所有方法还可以包含对扩增核酸产物测序的步骤。在某些实施方式中，所用的测序引物包括本文所描述的一种或多种寡核苷酸。在另一个方面，本专利技术提供了确定受试者FcγRIII基因型的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)扩增分离的核酸；(c)利用包含至少一种本文所述寡核苷酸(如SEQ ID NO1-19)的至少一种合适的寡核苷酸组合作为测序引物对扩增出的核酸产物进行测序，；以及(d)确定一种或多种FcγRIII多态性上的核苷酸残基，从而确定受试者的FcγRIII基因型。在某些实施方式中，扩增(步骤(b))至少利用包含至少一种本文所述寡核苷酸作为正义和反义引物的寡核苷酸的第一和第二组合进行。在本文所描述的任何测序方法中，例如通过确定207位的核苷酸可以确定FcγRIIIa第158V/F位的基因型(例如，207位上只有核苷酸G说明是158VV基因型，207位上只有核苷酸T说明是158FF基因型；以及207位上有核苷酸G和T说明是158FV基因型)。另一方面，本专利技术提供了区分FcγRIIIa和FcγRIIIb的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)利用包含至少一种本文所述寡核苷酸(如SEQ ID NO1-19)的寡核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含长度为１０－６０个核苷酸的核苷酸序列的分离的寡核苷酸，该核苷酸序列包含：（ａ）选自ＳＥＱＥＤＮＯ：１－１９的序列；（ｂ）与（ａ）的核苷酸序列有８０％序列相同性的核苷酸序列；或者（ｃ）（ａ）和（ｂ）的互 补序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PG加西亚，SE威尔逊，GG张，
申请(专利权)人：希龙公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]