针对PLA*的反义寡核苷酸、组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了针对ｃＰＬＡ↓［２］的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸能抑制ｃＰＬＡ↓［２］蛋白的表达以及过氧化物产生，尤其是在吞噬细胞中。这些反义寡核苷酸是用于治疗炎症状况（尤其是关节炎），以及神经退化性疾病的高效药剂。所述反义寡核苷酸或含有所述反义寡核苷酸的组合物可用于治疗此类疾病的方法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及反义寡核苷酸在治疗医疗状况(medical condition)中的应用的领域。更具体而言，本专利技术描述了用于抑制磷脂酶A2(PLA2)以及治疗与该分子激活关联的状况的新型反义寡核苷酸。
技术介绍
整个本申请提及的所有出版物都通过引用被全部并入此处，包括其中引用的所有参考文献。炎症是人体对损伤、感染或对被免疫系统认为是外来物质的分子的反应。缺少、过度或者不受控制的炎症导致大量的一系列疾病，诸如哮喘、关节炎以及自身免疫性疾病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、心血管炎症以及胃肠炎症。大量的研究证实，预致敏中性粒细胞(primedneutrophils)、单核细胞以及巨噬细胞参与了这类炎性疾病。最近，也有文献记载了由小胶质细胞(microglia cells)释放的过氧化物在神经退化性疾病的发病机理中的作用，所述神经退化性疾病的实例包括阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease)(AD)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)(PD)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)以及缺血性和创伤性脑损伤。由吞噬细胞NADPH氧化酶产生的过氧化物和由磷脂酶A2产生的促炎脂质介质(proinflammatory lipid mediators)对宿主防御而言属于最重要的功能之内。然而，在改变的生理状态下，过氧化物和脂介质会促进炎症反应并参与导致组织损伤的过程以及各种炎性疾病的病理生理学过程。现今，非甾体抗炎药物(NSAIDs)是用于治疗炎性状况的最广泛的处方药物中的一种。然而，它们具有不利的副作用，最常见的是胃肠道的溃疡和出血。此外，这些药物仅仅降低前列腺素的产生而不影响在将中性粒细胞聚集至炎症位点的过程中起关键作用的白三烯(leukotrienes)的产生。因而，人们仍在继续寻求新的副作用更小的抗炎药物的研究。人们对阻断炎症级联反应的因子进行了大量的试验，诸如皮质类固醇、抗内毒素抗体、TNF拮抗剂、IL-1受体拮抗剂和其它因子，都没有获得显著的成功。本专利技术人开发了一种细胞系，该细胞系是缺乏胞液型磷脂酶A2(PLA2)表达的PLB-985细胞系的稳定的克隆，并证实了cPLA2除了已知的在促炎脂质介质的产生中的作用外，还是吞噬细胞NADPH氧化酶复合体组装后的激活过程中的关键物质。这两个酶之间的关联提供了cPLA2释放的花生四烯酸(AA)激活组装的NADPH氧化酶的分子基础。由于氧化酶激活需要cPLA2，对其抑制应该不仅能消除炎症介质的形成，而且应该还能调节参与炎性疾病发病机理的氧自由基的不受控制的加速释放。此外，专利技术人的研究显示在体内(in vivo)的炎症或者在体外(in vitro)的炎症状况中，cPLA2和NADPH氧化酶两者的水平和活性在中性粒细胞和单核细胞中都会升高。令人惊讶的是，一份最近的报告报道，向中心粒细胞添加cPLA2抑制剂吡咯烷不会抑制NADPH氧化酶的活性，然而这个结果可能归因于所应用的方法学，该方法不能够使药物在中性粒细胞中得到足够的积累(数据未示出)。尽管有关于通过抑制cPLA2而治疗炎症状况的方法的报道，但这些方法涉及了使用诸如导致呼吸道炎症的剂量依赖性衰减的三氟甲基酮(trifuoromethylketone)(TFMK)，或抑制各种形式的PLA2的吲哚化合物之类的物质，但用于治疗炎症的特异针对cPLA2的抑制剂至今未有报道。目前，还未有有效的胞液型PLA2抑制剂可供人和动物的临床应用。迄今针对cPLA2的所有抑制剂都被设计成与底物的竞争。由于所有类型的PLA2都在磷脂的顺-2位切开脂肪酸，因此它们均被相同的抑制剂所抑制(尽管有时效率更低)。尽管有报道显示数个化合物作为cPLA2的特异抑制剂，但发现它们也能抑制其它PLA2酶，反之亦然。因为缺少对于每一PLA2亚型的特异抑制剂，反义技术提供了一种抑制特定类型的PLA2的有效途径。诚然，此处表明的结果提示，直接靶向cPLA2的药物将特异性地抑制cPLA2的活性。此外，它也导致对产生促炎脂质介质和过氧化物的cPLA2和NADPH氧化酶两者的调节。过去已经有报道靶向cPLA2mRNA序列的反义寡核苷酸能抑制cPLA2的转录表达。然而，这些寡核苷酸没有证实不抑制cPLA2的蛋白表达的抑制，并且其在脂质体lipofectin的存在下被导入细胞。此外，已有文献描述了靶向cPLA2的其它三个反义寡核苷酸P1(表1，序列8(SEQ.ID.No.8))；P2(表1，序列9)；以及P3(5’-GTGCTGGTAAGGATCTAT-3’；序列12)，主要评估了抑制cPLA2在平滑肌细胞和人单核细胞功能中的影响。P1与lipofectin一起使用。P1和P2，其所有碱基都用硫代磷酸(phosphorothioate)修饰，仅在5μM使用时才会有显著作用，而本专利技术人发现这个浓度对细胞有毒性。P3在10μM下使用(或甚至更高的浓度下，比本专利技术人使用的浓度高10倍)因此，本专利技术的一个目的在于提供针对cPLA2mRNA的新型反义寡核苷酸，以及它们在抑制cPLA2表达和过氧化物产生中的应用，以抑制促炎过程。因而，本专利技术所权利要求的反义寡核苷酸也寻求作为抗炎剂。随着说明书的进程，本专利技术其它的应用和目的将得到阐明。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了针对胞液型磷脂酶A2(cPLA2)mRNA序列的开放阅读框(ORF)的反义寡核苷酸，以及其功能类似物(functionalanalogs)、衍生物或片断，其中所述反义寡核苷酸的互补性(complementarity)在所述ORF的核苷145至400之间的区域内，且其中所述反义寡核苷酸能抑制cPLA2蛋白的表达。在一个实施方案中，本专利技术的反义寡核苷酸的长度从15至达30个核苷酸，优选地长度为17至21个核苷酸。所述针对cPLA2mRNA序列的开放阅读框的5’区域的反义寡核苷酸的序列具有如序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6中的任一序列表示的序列，详情见表1。本专利技术的反义寡核苷酸的序列可以被化学修饰，以便于获得更好的核酸内切酶抗性。从而，在本专利技术反义寡核苷酸的另一实施方案中，硫代磷酸化修饰可以存在于所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上。此外，可在所述寡核苷酸的第十个核苷上发现另一硫代磷酸化修饰，正如在如序列4和序列5表示的寡核苷酸中。在本专利技术反义寡核苷酸序列的另一实施方案中，进一步的修饰，诸如2-O-甲基化，可在所述寡核苷酸的最前三个和/或最后三个核苷上发现。作为本研究所带来的特性的结果，反义寡核苷酸可用于与cPLA2表达相关的炎症过程的抑制剂。从而，本专利技术反义寡核苷酸用作治疗和/或预防风湿性关节炎、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、哮喘、鼻炎、先天性肺纤维化、腹膜炎、心血管炎症、心肌缺血、再灌注损伤、动脉硬化症、脓血症、创伤(trauma)、II型糖尿病、视网膜病、银屑病、胃肠炎症、硬化和炎症性肠病，以及神经退化性疾病，诸如阿兹海默氏症(AD)、帕金森氏症(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)以及缺血性和创伤性脑损伤中的任一种，即在发病机理中氧化胁迫(oxidative stress)具有显著作用，以及由于活性小胶质细胞而具有类花生酸(eicosanoid)和过氧化物的加速释放的所有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对胞液型磷脂酶Ａ↓［２］（ｃＰＬＡ↓［２］）ｍＲＮＡ序列的开放阅读框（ＯＲＦ）的反义寡核苷酸，以及其功能类似物、衍生物或片断，其中所述反义寡核苷酸的互补性在所述ＯＲＦ的核苷１４５至４００之间的区域内，且其中所述反义寡核苷酸能抑制ｃＰＬＡ↓［２］蛋白的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉黑尔利维，
申请(专利权)人：莫尔研究应用有限公司，内盖夫研究发展机构本古里大学，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]