一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。采用“一锅式”原位合成法，碱性条件下，将血红素与氯金酸混合，进而以血红素作为还原剂和稳定剂，实现金的原位生物矿化，制得具有Hemin过氧化物酶催化和金催化活性的Hemin‑ AuNCs复合物；发挥其纳米导线功能，促进了Hemin催化反应的电子传输能力，同时增强了对底物的吸附能力，其催化活性显著高于常见Hemin（4倍以上）；制备方法不涉及复杂光电仪器使用，具有催化活性高、操作简单、响应快速、成本低廉等优点。以癌症标志物甲胎蛋白的免疫分析为例，将该Hemin‑ AuNCs复合物应用于标记AFP抗体，然后采用酶联免疫吸附法，通过酶催化和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中癌症标志物甲胎蛋白的高灵敏检测。

Preparation method and application of double catalytic functional analog enzyme based on heme mediated gold mineralization pathway

The invention provides a preparation method and application of a double catalytic function mimetic enzyme based on heme mediated gold mineralization pathway. The \one pot\ in situ synthesis method, under alkaline conditions, the heme and chloroauric acid and mixed with hemoglobin as a reducing agent and stabilizer, in situ biomineralization of gold, Hemin AuNCs complexes prepared with Hemin peroxidase catalysis and catalytic activity of gold nanowires; play its function, promote the the electronic transmission capacity of Hemin catalytic reaction, and enhanced the adsorption capacity of the substrate, the catalytic activity was significantly higher than that of common Hemin (4 times); the preparation method does not involve complex photoelectric instrument, has the advantages of high catalytic activity, simple operation, fast response, low cost etc.. The immune cancer marker alpha fetoprotein analysis as an example, the Hemin AuNCs compounds were used to label AFP antibody, then by ELISA, amplified by means of enzyme catalysis and catalysis of gold silver deposition signal, realizes the high sensitive detection of cancer markers in the blood.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶催化与传感检测
，涉及一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。
技术介绍
酶联免疫吸附法(ELISA)和金催化银沉积染色法是两种常见的高灵敏检测技术，在疾病标志物（如蛋白质和生物小分子）检测中得到了广泛的应用。这两类检测技术分别涉及抗体的酶标记和金标记，例如，辣根过氧化物酶（HRP）常用于标记抗体，但存在价格昂贵、容易失活、储存条件苛刻等局限性。因此，选用价格低廉又具有高催化活性的类酶催化剂代替HRP成为目前ELISA检测
的研究热点。此外，氯化血红素和亚铁血红素是HRP等血红素类蛋白质的催化活性中心，能够催化H2O2氧化底物反应产生颜色变化，表现出了类过氧化物酶的活性。然而，将血红素直接应用于各种催化领域仍然面临很大的挑战，例如，血红素本身催化活性低且不溶于水，在水溶液中易聚集成催化活性很低的二聚体，同时，其在氧化性媒介中结构易被破坏而致催化活性减弱。为了解决这些问题，研究工作者们尝试采用对血红素进行化学修饰或固定化以改良其催化性能。近年来，随着纳米制备技术的高速发展，贵金属纳米材料也被广泛用于改善蛋白酶及其模拟物的催化活性。采用纳米金颗粒修饰过氧化物酶以提高其催化性能的研究已被广泛报道；特别是，经过生物矿化生成的小尺寸（小于5nm）金纳米颗粒不仅本身具有一定的过氧化物酶活性，而且尚具有优良的催化银沉积活性。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，通过模拟天然酶的催化原理，制备基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，即Hemin-AuNCs复合物。同时，本专利技术还提供了上述Hemin-AuNCs复合物的应用，并以癌症标志物甲胎蛋白(AFP)的免疫分析为例，将之应用于标记AFP抗体。进而采用酶联免疫吸附法（ELISA），分别通过酶催化TMB-H2O2比色和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中AFP的高灵敏检测。本专利技术的技术方案如下：一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.05～1.25mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0M的NaOH溶液；（2）将步骤（1）制备的HAuCl4溶液与Hemin溶液各1.0mL等体积混合，5min后，剧烈搅拌下加入20～200μLNaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，0～80℃反应1～12h，离心分离，取上清液去离子水透析处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin-AuNCs复合物）。步骤（1）中，所述的Hemin溶液，浓度优选0.8mg/mL。步骤（2）中，所述的NaOH溶液用量优选120μL步骤（2）中，所述的反应，温度优选37℃，时间优选8h；步骤（2）中，所述的离心，优选8000r/s离心20min；步骤（2）中，所述透析时间优选12h；所述的透析采用规格为14KDa的透析袋。上述制备方法中，所述室温为20～25℃；所述的溶液均由二次去离子水配制；制得的基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶于4℃保存。本专利技术中血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的应用，用于血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）的高灵敏检测,包括酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）和金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）。所述的酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），通过酶催化TMB-H2O2比色检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin-AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法，步骤为：1）建立待测样品校准曲线方程：ⅰ）取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，加PBS缓冲液配制为2mL0.1-0.4mg/mL的Hemin-AuNCs溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）使其浓度分别为100mM和80mM，于20～25℃活化培育30min；步骤ⅰ）中，所述Hemin-AuNCs溶液浓度优选0.35mg/mL；ⅱ）将步骤ⅰ）得到体系与AFP抗体溶液混合，使混合后AFP抗体浓度为3.0μg/mL，4℃孵育10～12h后，用柠檬酸缓冲液或PBS缓冲液洗涤，得到标记Hemin-Au的AFP抗体，备用；ⅲ）向清洗干净的96孔板中加入10～40μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液，20～25℃放置0.5～2h，然后加入20μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液，20～25℃反应0.5～2h；步骤ⅲ）中，所述的96孔板为氨基功能化96孔板；所述壳聚糖的柠檬酸缓冲液优选加入20μL，20～25℃放置1h；加入戊二醛的PBS缓冲液后，优选20～25℃反应1h。ⅳ）取AFP抗体溶液，采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25mg/mL的AFP抗体稀释液，将步骤ⅲ）得到体系用PBS缓冲液清洗两次后，加入20μLAFP抗体稀释液，20～25℃培养5～10h；步骤ⅳ）中，优选培养8h。ⅴ）将步骤ⅳ）得到体系用PBS缓冲液清洗后，加入质量浓度为0.05～0.2%的牛血清白蛋白（BSA），然后于20～25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点；步骤ⅴ）中，牛血清白蛋白加入量优选0.10%；ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.01～0.30mg/mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；步骤ⅵ）中，所述浓度梯度优选12个梯度。ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；ⅷ）分别向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200μLTMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线，得AFP校准曲线方程；步骤ⅷ）中，所述TMB-H2O2底物显色液配制方法：a）称取TMB溶解于二甲亚砜中配制成1mg/mL的TMB溶液，避光4℃保存；b）将1.02g柠檬酸和3.68gNaH2PO4·12H2O加入100mL水中，震荡摇匀，得底物缓冲液，备用；c）将TMB溶液、底物缓冲液和30wt%H2O2按体积比1：9：0.01混合即得。2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白(AFP）含量：ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55ng/mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，于37℃培养1h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200μLTMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20min后，在波长652本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.05～1.25 mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的 NaOH溶液；（2）将步骤（1）制备的HAuCl4溶液与Hemin溶液各1.0 mL等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入20～200μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，0～80℃反应1～12 h，离心分离，取上清液去离子水透析处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶。

【技术特征摘要】
1.一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.05～1.25mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0M的NaOH溶液；（2）将步骤（1）制备的HAuCl4溶液与Hemin溶液各1.0mL等体积混合，5min后，剧烈搅拌下加入20～200μLNaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，0～80℃反应1～12h，离心分离，取上清液去离子水透析处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的Hemin溶液浓度为,0.8mg/mL。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的NaOH溶液用量为120μL；所述的反应，温度为37℃，时间8h；所述的离心为8000r/s离心20min；所述透析时间为12h，采用规格为14KDa的透析袋。4.一种权利要求1-3任一项所述方法制备的血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的应用，其特征在于：用于血液中癌症标志物甲胎蛋白的高灵敏检测，包括酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白和金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，通过酶催化TMB-H2O2比色检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin-AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法，步骤为：1）建立待测样品校准曲线方程：ⅰ）取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，加PBS缓冲液配制为2mL0.1-0.4mg/mL的Hemin-AuNCs溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺使其浓度分别为100mM和80mM，于20～25℃活化培育30min；ⅱ）将步骤ⅰ）得到体系与AFP抗体溶液混合，使混合后AFP抗体浓度为3.0μg/mL，4℃孵育10～12h后，用柠檬酸缓冲液或PBS缓冲液洗涤，得到标记Hemin-Au的AFP抗体，备用；ⅲ）向清洗干净的96孔板中加入10～40μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液，20～25℃放置0.5～2h，然后加入20μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液，20～25℃反应0.5～2h；ⅳ）取AFP抗体溶液，采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25mg/mL的AFP抗体稀释液，将步骤ⅲ）得到体系用PBS缓冲液清洗两次后，加入20μLAFP抗体稀释液，20～25℃培养5～10h；ⅴ）将步骤ⅳ）得到体系用PBS缓冲液清洗后，加入质量浓度为0.05～0.2%的牛血清白蛋白，然后于20～25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点；ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.01～0.30mg/mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；ⅷ）分别向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200μLTMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线，得AFP校准曲线方程；2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量：ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55ng/mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，于37℃培养1h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1h，然后用PBS洗涤两次...

【专利技术属性】
技术研发人员：王桦，张立燕，姜耀，刘凤娟，刘敏，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37